[發明專利]識別對蝦白斑桿狀病毒單鏈抗體的制備方法

無效

• 申請號: 00114500.2
• 申請日: 2000-04-19
• 公開（公告）號: CN1318564A
• 公開（公告）日: 2001-10-24
• 發明（設計）人: 戴和平;高宏;趙新顏;戴玲芬;張憲孔
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08
• 代理公司: 武漢科宏專利事務所
• 代理人: 王敏鋒

本發明涉及水產養殖生物病毒抗體，更具體涉及對蝦病毒單鏈抗體的制備方法。

1993年以來，我國蝦病爆發性流行，引起養殖的對蝦大面積死亡，經濟損失慘重。研究表明，其主要是由一種新的沒有包涵體的C型桿狀病毒—對蝦白斑桿狀病毒所致。該病毒可以感染我國所有人工養殖的對蝦種類，感染性強，發病快，死亡率高，給對蝦養殖業帶來極大的危害；據報道，其它國家和地區也有類似情況。目前，對對蝦病毒病尚無有效的治療方法，避免與病毒病源接觸被認為是最有效的預防措施。而這主要依賴于早期的快速診斷。目前的診斷方法主要有核酸探針技術和酶聯免疫吸附技術。核酸探針技術對技術條件要求高，廣大蝦農掌握此技術難度很大，難以推廣；酶聯免疫吸附技術雖可在養蝦場應用，但由于此法所需的多克隆抗體和單克隆抗體制備麻煩、費用高，限制了該技術的應用和發展。

本發明的目的是提供一種可批量生產、操作簡單、使用方便、成本較低的能識別對蝦白斑桿狀病毒單鏈抗體的制備方法。

噬菌體抗體展示是利用基因工程技術模擬自然免疫選擇系統來制備抗體，本發明采用噬菌體抗體展示技術，制備能識別對蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體。本發明包括如下步驟：首先從感病斑節對蝦的血淋巴液中分離純化白斑桿狀病毒，將抗體片段的基因克隆到絲狀噬菌體N-末端第三蛋白基因區域，表達的融合蛋白在噬菌體尾尖表面展示。具有抗原結合活力的抗體片段若由重鏈和輕鏈的可變區域組成，由一可彎曲的小肽連接成為氨基酸單鏈的形式，稱為單鏈抗體。單鏈抗體片段的獲得是通過PCR技術對免疫過或未免疫的小白鼠脾臟mRNA進行反轉錄和擴增，克隆到噬菌體表達載體上。具有抗原結合活力的噬菌體抗體可直接利用抗原親和性從重組噬菌體抗體文庫中淘選，通過調節琥珀中止密碼的活性，可選擇性地獲得與噬菌體融合的抗體或可溶性抗體。其具體制備方法為：

1、采用蔗糖密度梯度超速離心法，用電鏡檢測，從感病斑節對蝦的血淋巴液中分離純化白斑桿狀病毒。

2、用蛋白量為20～150μg純化的完整對蝦白斑桿狀病毒粒子注射小鼠，用Titremax佐劑或福氏佐劑或氫氧化鋁等常用佐劑，經17～26天進行二次或三次免疫，再經3～5天用酶聯免疫印跡法和酶聯免疫吸附法測定抗體效價，取抗體效價最高的小鼠脾臟，從中提取mRNA。

3、將此mRNA反轉錄為cDNA，再用對應于重鏈和輕鏈抗體可變部位DNA的引物通過PCR技術將抗體的重鏈和輕鏈的可變片段的DNA擴增。

4、用一編碼可彎曲小肽的DNA小片段將重鏈和輕鏈DNA片段連接起來組成單鏈抗體DNA，再用對應診斷單鏈抗體DNA的引物用PCR技術將整個片段擴增。

5、將單鏈抗體DNA片段兩端的限制性內切酶位點(SfiⅠ和NotⅠ)酶切，再與具同樣酶切位點的噬菌體表達載體連接，電轉移至大腸桿菌中，可獲得較高效價的噬菌體抗體cDNA文庫。

6、用吸附在朔料管壁上的對蝦白斑桿狀病毒對上述噬菌體抗體文庫進行1～4次淘選，用酶聯免疫吸附法篩選可得到抗原結合專一性的陽性克隆，該陽性克隆分泌的單鏈抗體可專一性識別對蝦白斑桿狀病毒。

本發明的優點與效果：

本發明不僅避免了在制備多克隆抗體過程中由個體引起的效價及專一性的差異，也避免了在制備單克隆抗體過程中繁雜的雜交瘤技術，操作簡易、費用較低，篩選范圍廣，可批量制備抗體，一旦獲得所需的抗體，就可獲得該抗體的基因，為抗體的進一步應用提供了多種可能性。同時本發明制備的單鏈抗體分子量只有天然抗體分子量的五分之一，容易穿透細胞間隙，到達靶位。實驗證明，單鏈抗體更容易中和病毒，其抗原親和性也高于天然抗體。使用本發明已篩選到180多個具抗原結合專一性的陽性克隆，從中選取效價高，特異性強的單鏈抗體可直接用于診斷對蝦白斑桿狀病毒，適合對蝦病毒病的早期檢測，其中可中和對蝦白斑桿狀病毒的單鏈抗體基因可轉入適合的載體，用于對蝦白斑桿狀病毒病的防治。

實施例：1)采用蔗糖密度梯度超速離心法，用電鏡檢測，從感病斑節海南

島對蝦的血淋巴液中分離純化白斑桿狀病毒。2)用蛋白量為100μg純化的完整的對蝦白斑桿狀病毒粒子注射到

小鼠的腹膜間(57xDBA?hybrids)，佐劑為Titremax,21天后

進行第二次免疫。4天后用酶聯免疫印跡法(Dot?Blot)和酶

聯免疫吸附法(ELISA)測定抗體效價。取抗體效價最高的小

鼠脾臟，用Invitrogen?Fast公司生產的TrackTM2.0試劑盒

從中提取mRNA。3)將此mRNA反轉錄為cDNA，再用對應于重鏈和輕鏈抗體可變部