[發明專利]固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸生產左旋氨基酸的方法

無效

• 申請號: 00113235.0
• 申請日: 2000-01-18
• 公開（公告）號: CN1306092A
• 公開（公告）日: 2001-08-01
• 發明（設計）人: 覃業亞
• 申請（專利權）人: 覃業亞
• 主分類號: C12P13/04
• 分類號: C12P13/04
• 代理公司: 湖南省常德市專利事務所
• 代理人: 唐治芳

本發明涉及一種生化制品的生產方法，即固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸生產左旋氨基酸的方法，D,L-N-乙酰基氨基酸的制取、固定化載體及固化方法、D-N-乙酰基氨基酸外消旋的方法。

氨基酸是指分子中既含有氨基又含有羧基的一類化合物的總稱。它是構成生物體蛋白的基本物質。隨著現代科學技術的發展，氨基酸已廣泛應用于醫藥、生化農藥、食品調味劑及強化營養劑、植物生長調節劑、皮革、日用化妝品、保健等領域，應用范圍日益擴展。

自然界賦存的氨基酸一般為左旋體，存在于動植物體中，是具有生物活性的一類。從以肽鏈形式結合的多種氨基酸構成的生物蛋白中提取左旋氨基酸，一方面組分復雜，分離純化成單一結晶的氨基酸，工藝繁長，收率極低；另一方面，環境污染十分嚴重，因而為現代社會逐步淘汰。

人工合成氨基酸，產量大，收率高，但除甘氨酸外，均為左旋體與右旋體的混合物。右旋體氨基酸往往對生物機能產生毒副作用或不具備生物活性，所以，對人工合成的氨基酸往往要進行左、右旋體的拆分，以達到一定的光學純度。

左、右旋體氨基酸由于空間結構的不同，使平面偏振光發生相同角度、不同方向的偏轉，表現出各異的生物性能，但由于分子結構一樣，故而其物理性質沒有明顯的差異，而化學性質完全一樣，分離左、右旋體十分困難。

本發明的目的是提供一種固定化氨基酰化水解酶高效拆分外消旋氨基酸生產左旋氨基酸的方法。

本發明的原理是：1、D,L-N-乙酰基氨基酸的制取2、D,L-N-乙酰基氨基酸酶拆分CO₂^-????CO₂^-OH₃N-C-H⁺+H-C-N-C-CH₃R????R?HL-氨基酸????D-N-乙酰基氨基酸3、D-N-乙酰基氨基酸外消旋

本發明推出的固定化氨基酰化水解酶拆分外消旋氨基酸的方法步驟如下：

(1)弱酸性陰離子交換樹脂經平衡后，裝柱。將氨基酰化水解酶(市售品)制成1000～1500μ/ml水溶酶，在42～45℃以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速通過載體柱，進行酶的固定化。當固定化酶活力達到500～700μ/g載體時，固酶完畢。然后用0.15M醋酸鈉溶液洗滌。

(2)將D,L-N-乙酰基氨基酸配成5～10％(w/w)水溶液，用Na₂CO₃或NH₃·H₂O調整溶液PH為6.5～10.0。

(3)將D,L-N-乙酰基氨基酸底物溶液在42～45℃保溫狀態下，以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速通過酶柱，進行拆分。

(4)拆分液在60～70℃真空減壓濃縮至原體積的1/2～1/4，冷卻至0～5℃，攪拌結晶，分離后經乙醇或甲醇洗滌，干燥得左旋氨基酸。

(5)調整結晶母液PH1.0～5.0，攪拌升溫后用硫酸或鹽酸調整PH1.5～5.0，靜置冷卻結晶，分離干燥得D-N-乙酰基氨基酸。

(6)將D-N-乙酰基氨基酸用1.5～3重量份水溶解，加入其理論用量1～3倍乙酸酐，升溫至60～70℃，攪拌3-5小時，然后冷卻至0～5℃，結晶≥5小時，離心脫水后，在40～100℃干燥，得D,L-N-乙酰基氨基酸。

本方法中涉及的D,L-N-乙酰基氨基酸是按如下步驟制取的。

取一重量份的D,L-氨基酸，投入搪瓷反應釜中，加入1-5重量份水，在攪拌狀態下，滴加其理論用量1.5～2.0倍的醋酐，控制合成溫度為25～50℃，滴加完畢后，在25～50℃保溫攪拌5～10小時，置于搪玻璃結晶釜中，冷卻至0～5℃，加入結晶促進劑，攪拌結晶≥5小時，離心分離，得D,L-N-乙酰基氨基酸。

本發明所涉及的固定化載體及固化方法如下：

(1)固定化酶載體采用弱酸性陰離子交換樹脂。

(2)將一重量份的樹脂浸泡于3重量份0.2N?NaoH溶液中，靜置30小時，然后用去離子水漂洗至PH7～8，再浸泡于3重量份0.2N鹽酸溶液中，靜置30小時，然后用去離子水漂洗至PH5～6。

(3)將經上述處理的樹脂裝柱，恒溫至43±1℃；將氨基酰化水解酶恒溫至43土1℃，以0.01～0.05mL/min·g載體的流速勻速從載體柱底部向上通過；用43土1℃的去離子水通過酶柱，此時固定酶活力達到500～700μ/g載體，在43±1℃恒溫備用。

本發明所涉及的D-N-乙酰基氨基酸外消旋是按如下步驟進行的：