[發(fā)明專利]生物芯片檢測中的分子放大

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00111984.2
• 申請日: 2000-03-10
• 公開（公告）號: CN1313404A
• 公開（公告）日: 2001-09-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李民乾;李賓;周志東
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院上海原子核研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海華東專利事務(wù)所
• 代理人: 張澤純

本發(fā)明涉及生物芯片(或稱DNA芯片、基因芯片)，特別是一種在生物芯片檢測過程中雜交信號分子放大技術(shù)。????

生物芯片是20世紀(jì)90年代的重大生物新技術(shù)，是微電子與生物技術(shù)的交叉成果。生物芯片的檢測以物理學(xué)的熒光檢測為主。至今已有兩種類型：

1、點掃描的共聚焦(Confocal)型檢測儀；

2、基于電荷藕合檢測器(CCD)的成像型檢測儀，例如“SHLI?Ⅱ型生物芯片檢測儀。

目前，應(yīng)用DNA芯片來檢測DNA樣品是先將樣品單鏈DNA用熒光標(biāo)記，再將熒光標(biāo)記的單鏈樣品DNA加入到已經(jīng)制作好的DNA芯片中，使它們充分相互接觸反應(yīng)即雜交反應(yīng)。根據(jù)堿基配對原理，在一定的條件下，與DNA芯片上已知核苷酸陣列完全配對的熒光標(biāo)記樣品DNA就被固定在芯片一定的位置上，而不配對的單鏈樣品DNA會被沖洗掉。通過Confocal檢測芯片上熒光的位置和強(qiáng)度可獲得樣品DNA的生物信息。此方法的特點是可得到高清晰度的DNA芯片掃描圖象，但其最大的不足是其昂貴的儀器價格，使它不能在研究所和醫(yī)院中廣泛推廣，這就是前者的問題。后者較便宜，易于推廣，但是對某些應(yīng)用，靈敏度尚嫌不足，雖然對互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)微陣列芯片靈敏度尚可，而對疾病診斷等DNA芯片則嫌不夠。

本發(fā)明的目的就是為了克服上述困難，利用價廉的生物芯片檢測儀同樣可獲得高清晰度的DNA芯片雜交信號圖象，提出了一種生物芯片雜交信號分子放大技術(shù)。

本發(fā)明的實質(zhì)就是把DNA雜交信號分子放大機(jī)制引入DNA芯片的檢測系統(tǒng)中，并利用我們已申請的前專利“生物芯片檢測儀”(專利申請?zhí)枮?9240088.0)進(jìn)行檢測，即可獲得高清晰的DNA芯片雜交信號熒光圖象。

本發(fā)明的生物芯片雜交信號分子放大，包括：將樣品單鏈DNA加入到DNA芯片中進(jìn)行雜交反應(yīng)，清洗和檢測，其特點是所說的樣品單鏈DNA加入到DNA芯片中要通過雜交前方法或雜交后方法，將熒光微球特異地連接到DNA芯片上雜交的雙鏈DAN上。

生物分子熒光信號放大目前有三種方法可供選用，即生物素——親和素系統(tǒng)、酶系統(tǒng)和熒光微球系統(tǒng)。

在DNA芯片檢測中較簡單方便的是通過雜交前方法或雜交后方法將熒光微球特異性地連接到DNA芯片上雜交雙鏈DNA上。

所說的“雜交前”方法就是：

(1)先對樣品單鏈DNA進(jìn)行處理，使其帶有活性基因。

(2)與DNA芯片雜交。

(3)清洗后再將帶有活性基團(tuán)的熒光微球與已雜交的DNA芯片上相對應(yīng)的活性基團(tuán)作用(生物素——親和素相互作用、氨基與羧基以及醛基進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)等)，從而將熒光微球連接到雜交的DNA雙鏈上而完成DNA芯片雜交熒光信號的分子放大。

所說的對樣品單鏈DNA進(jìn)行處理的方法已有很多成熟方法可供采用，包括：生物素化、氨基化、或地高辛化等。

例如生物素化的雜交前方法的步驟：

(1)先對樣品單鏈DNA進(jìn)行生物素化處理，使其帶有生物素(活性基團(tuán))；

(2)與DNA芯片雜交；

(3)清洗；

(4)將帶有親和素(活性基團(tuán))的熒光微球與已雜交的DNA芯片上相對對應(yīng)的生物素(活性基團(tuán))作用，將熒光微球連接到DNA雙鏈上。

對樣品單鏈的生物素化又有兩種方法：

(1)酶法，可用末端轉(zhuǎn)移酶經(jīng)末端轉(zhuǎn)移或DNA聚合酶經(jīng)隨機(jī)引物法或缺口平移法而生物素化。(2)化學(xué)法，如補(bǔ)骨脂素-生物素法、光生物素法等。利用已有的商業(yè)化補(bǔ)骨脂素-生物素試劑盒(補(bǔ)骨脂素-biotinlabelingkit)，可通過紫外照射將補(bǔ)骨脂素-生物素與樣品單鏈DNA連接，或通過光生物素經(jīng)可見光照射10分鐘而生物素化。

對樣品單鏈DNA氨基化：利用末端標(biāo)記法將8-氨基己烷-三磷酸脫氧腺嘌呤核苷酸標(biāo)記到DNA探針的3’末端，或通過對胞嘧啶、胸腺嘧啶、鳥嘌呤溴化后再二氨基己烷替換而氨基化樣品單鏈DNA。

對樣品單鏈DNA地高辛化的雜交前方法是：

(1)先對樣品單鏈DNA進(jìn)行地高辛化處理，

(2)與DNA芯片雜交；

(3)清洗；

(4)將帶有地高辛抗體的熒光微球連接到雜交的雙鏈DNA上。

所說的雜交后方法就是在雜交后利用特異性的DNA雙鏈嵌入試劑嵌入到已雜交的DNA雙鏈內(nèi)，再利用嵌入試劑的活性基團(tuán)與熒光微球上相對應(yīng)的活性基團(tuán)反應(yīng)，實現(xiàn)雜交信號分子放大。

所說的雜交后方法的步驟如下：

(1)樣品單鏈DNA與DNA芯片雜交；