[發明專利]用新的復性方法制備重組人神經生長因子

無效

• 申請號: 00111220.1
• 申請日: 2000-07-19
• 公開（公告）號: CN1334271A
• 公開（公告）日: 2002-02-06
• 發明（設計）人: 王革
• 申請（專利權）人: 王革
• 主分類號: C07K14/48
• 分類號: C07K14/48;A61K38/18;A61P25/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬醫藥領域中的重組蛋白質藥物。

重組人神經生長因子(human?nerve?growth?factor，簡稱rhNGF)是一種對正常神經細胞有營養作用，對損傷神經修復機能有調節作用的生物活性因子，它可維持交感神經和感覺神經的生存，促進神經細胞的分化，決定軸突的伸展方向。對促進大腦的發育，神經系統的生長，損傷神經的再生和功能恢復具有重要作用。

rhNGF可應用于糖尿病性周圍神經病變、老年癡呆病、帕金森氏病、面神經炎，以及神經損傷(包括脊髓損傷、高位截癱、斷指再植、腦損傷，周圍神經損傷等中樞及外圍神經系統的損傷)等神經系統疾病，是目前可應用于臨床的神經系統蛋白質因子。人神經生長因子在人體中含量甚微，天然來源幾乎不可能，以前人們試圖從小鼠中提取鼠源NGF，但存在種屬差異及致病微生物污染的問題。因此，用基因工程的方法生產重組人神經生長因子是唯一的選擇。

因為rhNGF不含糖基化位點，可以用大腸桿菌來表達。我們構建了高效表達rhNGF的工程菌以表達rhNGF。由于rhNGF含有三對二硫鍵，用細菌表達的rhNGF形成包含體形式，溶解變性后用常規方法復性很難正確折疊和復性成活性形式，產率很低。這是由于組成三對二硫鍵的六個半胱氨酸在復性時錯誤配對造成的。為了提高變性rhNGF的復性率，我們發明了用二硫鍵異構酶(PDI)促進復性的生產工藝，我們在rhNGF的復性體系中加入重組人二硫鍵異構酶(rhPDI)，使錯配的二硫鍵打開重新形成正確的二硫鍵，從而提高復性率，最終提高rhNGF的產率，降低成本，并可應用于工業化生產。

本發明的原理：二硫鍵異構酶PDI可以特異性地作用于蛋白分子中錯配的二硫鍵，打開該錯配二硫鍵，并促進其形成正確配對的二硫鍵，完成分子結構重排，形成正確活性形式，達到復性目的。

本發明的目的：使用二硫鍵異構酶催化變性的rhNGF形成正確配對的二硫鍵，從而復性成正確的有活性的分子構型。這樣可提高rhNGF的復性率，降低異構體比例，簡化后續純化步驟，由此提高rhNGF的產率，降低生產成本。

技術方案：用工程菌表達rhNGF→菌體破碎→包含體分離→尿素變性溶解→在復性體系中按一定比例加入重組人PDI以催化rhNGF的復性→脫鹽→陽離子交換層析。經上述步驟，即可制備得到純度大于95％，具天然生物學活性的rhNGF。

最佳實施例：

rhNGF的復性體系如下：25mM?Tris，pH7～10，1mM?EDTA，rhNGF蛋白濃度0.1～1mg/ml。在此復性體系中加入重組人二硫鍵異構酶PDI，使rhNGF與PDI的摩爾比為100∶1～10∶1。在加入PDI的復性體系中進行復性，rhNGF的復性率比不加PDI時有顯著提高，二硫鍵錯配造成的異構體比例大大降低，rhNGF的終產率也相應提高。

rhNGF制備方法如下：將表達后的rhNGF工程菌菌體離心收集，懸浮于25mM?Tris，pH8.0，超聲破碎并10000×g，30分鐘離心后制得rhNGF包含體。包含體用8M尿素，25mM?Tris，1mM?EDTA充分溶解后，10000×g，30分鐘離心，取上清，即為變性的rhNGF。

將變性的rhNGF逐滴滴入己加PDI的復性體系中，使得rhNGF終濃度達到0.5mg/ml，室溫下放置過夜。將上述復性液用脫鹽柱脫鹽后，再經過CM-Sepharose柱層析純化(平衡緩沖：20mM?PB，pH6.0，0～1MNaCl線性梯度洗脫)，得到純度＞95％，具天然生物學活性的rhNGF。

本發明的優點：本發明提供了一種用PDI促進變性的rhNGF折疊復性以制備rhNGF的新型工藝方法。它與傳統的rhNGF生產工藝相比具有以下特點：①變性rhNGF的復性率提高。②復性體系中rhNGF蛋白濃度可以提高，復性體積減少，操作方便，節省試劑。③異構體比例低，簡化了后續純化步驟。④提高rhNGF產率，降低生產成本。上述優勢使本發明具有明顯的技術創新性與工藝先進性，成本降低，更適合于工業化生產rhNGF。