[發明專利]發酵制備L－氨基酸的方法及編碼accDA基因的核苷酸序列

無效

• 申請號: 00109310.X
• 申請日: 2000-05-19
• 公開（公告）號: CN1275620A
• 公開（公告）日: 2000-12-06
• 發明（設計）人: 伊沃內·蒂爾格;洛塔爾·埃格林;伯恩哈德·艾克曼斯;赫爾曼·扎姆;貝蒂娜·默克爾
• 申請（專利權）人: 德古薩－于爾斯股份公司;于利希研究中心有限公司
• 主分類號: C12N15/09
• 分類號: C12N15/09;C12N15/10;C12N15/11;C07K14/34;C12P13/04;C12P13/08
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

本發明提供了編碼accDA基因的核苷酸序列，及通過用其中accDA基因被擴增的棒桿菌發酵制備L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸的方法。

L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸用于動物飼料，人的內服藥及制藥工業。

已知那些氨基酸由棒狀細菌，尤其是谷氨酸棒桿菌的菌株發酵生產。由于其非常之重要性，一直嘗試改進制備方法。改進的方法可涉及與發酵過程相關的措施，如攪拌及氧補給，或營養培養基基的組分如發酵期糖的濃度，或如經離子交換層析加工產物形式，或微生物自身的內在性質。

為改進那些微生物的性質，可使用誘變，選擇及突變體選擇方法，以此獲得對抗代謝物如賴氨酸同源物S-[2-氨乙基]-半胱氨酸有抗性的菌株，或在調節方面重要氨基酸的營養缺陷體，并產生L-氨基酸。

幾年來，通過擴增氨基酸生物合成的各個基因，并研究對L-氨基酸生產的影響，重組DNA技術已被用于改進谷氨酸棒桿菌的L-氨基酸生產菌株。此方面的文章見于Kinoshita(“谷氨酸細菌”，見工業微生物學，Demain和Solomon編輯，Benjamin?Cummings，英國倫敦，1985，115-142)，Hilliger(BioTec?2，40-44(1991))，Eggeling(氨基酸6，261-272(1994)，Jetten和Sinskey(Critical?Reviews?inBiotechnology?15，73-103(1995)和Sahm?et?al.(紐約科學院年報782，25-39(1996)。

乙酰輔酶A羧化酶催化乙酰輔酶A羧化為丙二酸單酰輔酶A。源自E.coli的此酶由4個亞單位組成。accB基因編碼生物素羧基載體蛋白，accC基因編碼生物素羧化酶，accA和accD基因編碼轉羧酶(Cronan和Rock，膜脂的生物合成，見《大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌》(F.C.Weidhardt編輯)1996，PP.612-636，美國微生物學會)，由于此酶羧化酰基輔酶A形式的?；?，因此其也稱為酰基輔酶A羧化酶。

谷氨酸棒桿菌的accBC基因的的核苷酸序列已由Jager等測定(Archives?of?Microbiology?166，76-82(1996))，且通?？蓮臍W洲分子生物學實驗室(EMBL，Heidelberg，Germany)的數據庫獲得，登記號為U35023。accBC基因編碼乙酰輔酶A羧化酶的攜帶生物素羧基載體蛋白結構域及生物素羧化酶結構域的亞單位。

本發明的目的是提供一種新的通過發酵制備L-氨基酸，尤其是L-賴氨酸的改良方法。

L-氨基酸尤其L-賴氨酸用于動物的飼料，人內服藥及制藥工業。因而提供新改進的制備L-氨基酸的方法通常是令人感興趣的。

應了解后文提及的任何L-賴氨酸或賴氨酸不只意味著其本體，也指鹽，如賴氨酸單鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽。

本發明提供了來自棒桿菌的一優選重組DNA，其能在棒狀微生物中復制，且至少含有示于SEQ?ID?NO：1的編碼accDA基因的核苷酸序列。

本發明還提供了如權利要求1所述的能復制的DNA，其具有：

(i)SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列，

(ii)至少一個在遺傳密碼簡并區內相應于(i)序列的序列，或

(iii)至少一個與互補于(i)或(ii)序列的序列雜交的序列，且任選地

(iv)在(i)內的中性有義突變。

本發明還提供了通過導入所述能復制的DNA而轉化的棒狀微生物，尤其棒桿菌屬。

本發明還涉及用棒桿菌經發酵制備L-氨基酸的方法，所述棒桿菌尤其是已產生L-氨基酸，且其中編碼accDA基因的核苷酸序列是擴增的，尤其是過量表達的。

最后，本發明還提供了一種在棒桿菌中，通過本發明的新accDA基因和已知accBC基因的聯合過量表達而擴增酰基輔酶A羧化酶的方法。

在此，術語“擴增”指通過增加基因的拷貝數應用強啟動子或應用編碼具有高活性的相應酶的基因或任選的這些措施的結合，從而增加微生物中由相應DNA編碼的一或多種酶的細胞內活性。

本發明提供的微生物可從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉、纖維素中，或從甘油和乙醇中生產L-氨基酸。尤其是棒狀細菌特別是棒桿菌屬。在棒桿菌屬中，特別提及的是谷氨酸棒桿菌，本領域技術人員已知其生產L-氨基酸的能力。

適當的棒桿菌屬尤其谷氨酸棒桿菌的菌株是下列的已知野生型菌株：