[發(fā)明專利]從血清和血漿中制備DNA的改進方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 00104698.5
• 申請日: 2000-02-03
• 公開（公告）號: CN1270962A
• 公開（公告）日: 2000-10-25
• 發(fā)明（設計）人: L·博格梅耶;K·L·安吉
• 申請（專利權）人: 奧索臨床診斷有限公司
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C07H1/08;C12Q1/68
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 譚明勝

本發(fā)明涉及從血清和血漿中制備DNA的方法，特別是在擴增反應中用作目的DNA的DNA制備方法。

擴增和檢測核酸領域的技術進展十分迅速，特別當其涉及對感染性疾病、癌癥和遺傳疾病提供早期檢測的商業(yè)診斷試驗時。目前已經(jīng)知道少量核酸的擴增，例如PCR(聚合酶鏈式反應)已相當成熟的技術(參見美國專利號4683195；4683202；和4965188)。PCR的內在靈敏性，即其擴增非常低濃度的目的DNA的能力，意味著PCR產(chǎn)物低水平的遺留以及樣品間的污染可以產(chǎn)生假陽性結果。在所有因素中，遺留和樣品污染是處理過程中所需的樣品操作次數(shù)的指標。因此，具有使樣品暴露于周圍環(huán)境的最少次數(shù)的簡單程序是非常理想的。

傳統(tǒng)上，已經(jīng)就由全血得到的外周血白細胞(WBC)中經(jīng)PCR鑒定了人巨細胞病毒(HCMV)感染引起的病毒血癥，并鑒定了其它病毒和細菌。在從WBC中提取HCMV?DNA之前，通常需要從全血中分離WBC。這種分離程序包括紅細胞在葡聚糖溶液中的沉降(Rasmussen等，傳染病雜志.171：177-82，1995)，用氯化銨溶液差別溶解(美國專利號5702884，Ekeze等)，或者應用商業(yè)提供的方法(例如，來自Becton-Dickinson的CPT-Vacutainer^TM試管)。這些方法通常包括除去擴增的潛在抑制物的清洗步驟；或者，分離WBC以便除去這些抑制物，所述抑制物通常以高濃度存在于血漿或血清中。

分離出WBC后，溶解并提取DNA。這包括以下程序，例如煮沸、超聲、或WBC的冷凍干燥，或者應用蛋白溶解酶和/或表面活性劑溶解細胞，然后提取DNA。提取DNA還可以應用堿溶步驟(美國專利號5639599)。通常進行更嚴格的提取/純化步驟以便進一步確保純化到的DNA不含潛在抑制物，這些步驟包括，例如，應用玻璃珠(Gene?Clean?II試劑盒，Bio?101，Inc.)、酚-氯仿提取程序、聚合物捕獲(美國專利號5582988)，旋轉柱吸附(Qiagen?QLAamp試劑盒)，以及其它商業(yè)提供的DNA分離試劑盒(Puregene，Gentra?SystemsInc.)。

值得注意的是，用于從WBC制備物中清洗掉或除去潛在抑制物的分離和溶解WBC的程序不能被用于血漿和血清。由于大量內源性生化物質和服用藥物、藥物的代謝產(chǎn)物等在血清和血漿中保留并嚴重累積，因此現(xiàn)有技術需要一種適用于血漿和血清的快速和強效的方法，該方法將除去潛在抑制物或使該抑制物失效。

感染個體中的胞外HCMV核酸存在于血漿和血清中。選擇血漿和血清作為PCR檢測HCMV核酸的樣品正逐步被接受。通常，目的DNA不以游離DNA的形式存在，而作為與DNA、RNA和蛋白質的復合聯(lián)合體的形式存在。必須從復合物中提取DNA，然后變性，以便使其適用于擴增反應。通常對血清和血漿樣品進行加熱、表面活性劑處理、和蛋白酶處理。常使用另外一些精確的方案提取目的DNA，例如前面描述WBC時提到的那些(Spector等，臨床微生物學雜志，30：2359-65，1992；Nolte等，臨床微生物學雜志，33：1263-66，1995；Wolf等，移植，56：330-4，1993；Patel等，臨床微生物學雜志，32：1431-4，1994)。堿處理也曾被使用。然而，堿處理通常需要高NaOH濃度，隨后需要中和步驟(Hansen等，傳染病雜志170：1271-4，1994)。

因此，現(xiàn)有技術需要一種快速有效地從血清和血漿中提取DNA的并與PCR擴增方法相容的方法。

本發(fā)明提供了一種從血清或血漿樣品中提取DNA的方法。該方法包括：

(i)將血清或血漿與堿接觸，以制備堿化的血清或血漿；

(ii)將堿化的血清或血漿加熱至約100到110EC之間，保持約5到20分鐘；

(iii)離心加熱的堿化血清或血漿；和

(iv)提取含DNA的上清液。

在一個優(yōu)選的方面，在離心加熱的堿化血清或血漿之前，在步驟(iii)離心之前，將由步驟(ii)制備的加熱的堿化血清或血漿放冷，或冷卻至室溫，即25EC。

另一方面，本發(fā)明提供了一種檢測在血清或血漿中可能存在含DNA的微生物，例如人巨細胞病毒(HCMV)的方法。該方法包括：

(i)將血清或血漿與堿接觸，以制備堿化的血清或血漿；

(ii)將堿化的血清或血漿加熱至約100到110EC之間，保持約5到20分鐘；

(iii)離心加熱的堿化血清或血漿；

(iv)提取含DNA的上清液；