技術領域

本發明涉及一種異檸檬酸測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定異檸檬酸濃度的方法，屬于食品檢驗測定技術領域。

背景技術

異檸檬酸isocitric?acid是檸檬酸的異構體，雖然量少，但廣泛存在于生物界。在落地生根屬(Bryophyllum)等多汁植物的葉、或懸鉤子類中特別多，生物能夠利用的是D型。是三羧酸循環中的一個成分。檸檬酸在鳥頭酸酶的作用下可逆地生成異檸檬酸和順鳥頭酸。在異檸檬酸脫氫酶(EC?1.1.1.41；EC?1.1.1.42)的作用下變成α-酮戊二酸，在異檸檬酸裂合酶(isocitrate?lyase，EC4.1.3.1)的作用下變成琥珀酸與乙醛酸。

中華人民共和國國家標準，GB?T16771-1997，規定了橙、柑、桔汁及其飲料中D-異檸檬酸的測定方法-紫外分光光度法。該方法適用于判定橙、柑、桔濃縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5％的橙、柑、桔汁飲料的總D-異檸檬酸的測定。其測定原理：異檸檬酸脫氫酶isocitrate?dehydrogenase有兩種類型：以NAD為輔酶的酶(EC1.1.1.41)和要NADP為輔酶的酶(EC1.1.1.42)，兩者催化同一反應。

在異檸檬酸脫氫酶催化下，樣品中的D-異檸檬酸鹽與NAD或NADP作用，生成NADH或NADPH的含量，相當于D-異檸檬酸鹽的量。在波長340nm處測定吸光度，確定樣品中總D-異檸檬酸的含量。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用酶倍增法(Enzymatic?DoublingMethod)、酶比色法(Enzymatic?Colorimetric?Method)及酶(偶)聯法(CoupleReaction)技術，計量/連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定異檸檬酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的異檸檬酸測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行異檸檬酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明異檸檬酸濃度測定方法如下：

異檸檬酸+輔酶??異檸檬酸脫氫酶??二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶

二氧化碳+乙酸+亞鐵細胞色素b1??丙酮酸脫氫酶(EC?1.2.2.2)丙酮酸

??????????????????????????????????????????+高鐵細胞色素b1+水

丙酮酸+輔酶A+輔酶??丙酮酸脫氫酶(EC?1.2.1.51)二氧化碳+

?????????????????????????????????乙酰輔酶A+還原型輔酶

這種方法應用異檸檬酸脫氫酶(isocitrate?dehydrogenase；EC?1.1.1.41；EC1.1.1.42)酶(偶)聯丙酮酸脫氫酶(pyruvate?dehydrogenase；EC?1.2.2.2)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate?dehydrogenase；EC?1.2.1.51)酶促反應比色終點法。異檸檬酸脫氫酶酶解異檸檬酸反應產生二氧化碳，再通過(偶)聯合丙酮酸脫氫酶(EC1.2.2.2)、丙酮酸脫氫酶(EC?1.2.1.51)的作用，最終二次將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度，通過測量340nm處吸光度上升的程度，可以測算異檸檬酸的濃度大小。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明異檸檬酸測定試劑(盒)較為理想：

緩沖液???????????????????????100mmol/L

穩定劑???????????????????????500mmol/L

輔酶?????????????????????????3mmol/L

異檸檬酸脫氫酶???????????????10000U/L

丙酮酸脫氫酶(EC?1.2.2.2)?????12000U/L

丙酮酸脫氫酶(EC?1.2.1.51)????12000U/L

乙酸?????????????????????????7mmol/L