本發(fā)明公開了一種人源化IgG單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及制備方法，該方法包括如下步驟：針對(duì)病毒抗原進(jìn)行噬菌體抗體庫篩選，獲得達(dá)到親和力閾值需求的IgG原型抗體；對(duì)篩選得到的異源抗體進(jìn)行人源化改造獲得人源化IgG單克隆抗體；對(duì)篩選得到的人源抗體進(jìn)行框架優(yōu)化；需要時(shí)后續(xù)還可對(duì)獲得的人源化IgG單克隆抗體進(jìn)行體外親和力成熟；表達(dá)、純化以獲得人源化IgG單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料；對(duì)人源化IgG單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料進(jìn)行純度表征，蛋白質(zhì)活性表征和結(jié)構(gòu)表征；在純度充分表征和結(jié)構(gòu)確證與目標(biāo)抗體序列一致的基礎(chǔ)上，經(jīng)均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)，采用基于氨基酸分析的同位素稀釋質(zhì)譜法對(duì)單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及IgG抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種人源化IgG單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法。

背景技術(shù)

免疫學(xué)檢測(cè)是臨床檢測(cè)的重要方法之一，它是一種特異性的診斷方法，廣泛用于臨床檢測(cè)、確診和流行病學(xué)調(diào)查，可用已知抗原檢測(cè)未知抗體，也可用已知抗體檢測(cè)未知抗原(如：血清學(xué)檢測(cè))。免疫學(xué)檢測(cè)方法是利用抗原抗體之間的特異性和可逆空間結(jié)合來檢測(cè)目標(biāo)物。按檢測(cè)目標(biāo)物不同，免疫檢測(cè)方法主要可分為病毒抗原檢測(cè)和血清IgM/IgG抗體檢測(cè)；按檢測(cè)原理不同，可以分為膠體金法、免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學(xué)發(fā)光法等。免疫學(xué)檢測(cè)作為醫(yī)院診療工作的重要組成部分，為臨床診斷和治療用藥等提供依據(jù)，免疫學(xué)檢測(cè)的質(zhì)量對(duì)臨床診斷結(jié)果和治療效果有最直接的影響。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(ReferenceMaterial，RM)是具有一種或多種足夠均勻和很好確定了的特性值，用以校準(zhǔn)設(shè)備、評(píng)價(jià)測(cè)量方法或給材料賦值的材料或物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、一致、可比的主要工具，也是保證量值有效傳遞的計(jì)量實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)。隨著國家對(duì)體外診斷試劑監(jiān)督管理力度的加大和對(duì)檢測(cè)技術(shù)要求的不斷提高，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的需求和依賴也越來越強(qiáng)烈。血清IgG抗體檢測(cè)也需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)檢測(cè)方法和試劑盒進(jìn)行質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。

然而對(duì)于人源的臨床標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，很多標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料需要從病人血液中提取，這極大限制了臨床類標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。如果病人難找到、或者血液中含量很低，就需要考慮采用重組蛋白技術(shù)體外表達(dá)和純化。針對(duì)于難獲取原料的血清抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研發(fā)，如果不應(yīng)用重組蛋白技術(shù)設(shè)計(jì)、制備，很難想象有足量一致的、人源提取的血清來源抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及時(shí)分配、應(yīng)用于全世界，尤其是應(yīng)用于像新冠這種突發(fā)流行病危機(jī)。這也是現(xiàn)有的臨床診斷抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)數(shù)目只寥寥數(shù)種的原因，一是需要從病人血液提取，原料來源受限；二是針對(duì)提取的多克隆抗體的表征、定值難度太大，需要建立可應(yīng)用于它們的基準(zhǔn)定值方法。

具體來說，以急性傳染病為例，檢測(cè)試劑研發(fā)周期一般比較短，短時(shí)間難以開發(fā)研發(fā)和生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化流程，難免出現(xiàn)性能高低不一、品質(zhì)良莠不齊的問題。試劑盒性能評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制也非常急迫。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為準(zhǔn)確量值的載體，是評(píng)價(jià)試劑質(zhì)量的“砝碼”，并可以用于檢測(cè)方法開發(fā)與驗(yàn)證，對(duì)試劑盒研發(fā)和評(píng)價(jià)進(jìn)行質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)等。

現(xiàn)階段，試劑公司多直接采用陽性血清作為研發(fā)的質(zhì)控品。陽性血清是混合的病人滅活血清，未經(jīng)過提取純化，純度非常低且多克隆來源(因?yàn)槌搜寤|(zhì)和抗(病毒)抗原的抗體，還含有極高豐度的不抗(病毒)抗原的本底抗體存在)。它作為質(zhì)控品的缺陷是具有生物安全風(fēng)險(xiǎn)和批次來源差異，無法精確復(fù)制，也無法精確表征，更不用說在其基礎(chǔ)上研制純度、穩(wěn)定性、均勻性和定值精確性要求極高的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。很多廠家、研發(fā)機(jī)構(gòu)無法及時(shí)獲得陽性血清，在研發(fā)過程中只能依靠企業(yè)自行研制的物質(zhì)部分替代質(zhì)控品的功能，因此研制無生物安全風(fēng)險(xiǎn)、可精確復(fù)制、可準(zhǔn)確表征與定量的病毒抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)十分必要。

綜上所述，病人血清尤其是未知病毒引發(fā)的急性傳染病血清中的IgG屬于多克隆抗體，不易獲取、應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備，難以準(zhǔn)備表征、定值。利用單克隆抗體安全、易生產(chǎn)、可復(fù)制、能準(zhǔn)確表征、可應(yīng)用基準(zhǔn)方法準(zhǔn)確定值的特點(diǎn)，可設(shè)計(jì)、研制病毒單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用于如傳染病中血清抗體的免疫檢測(cè)方法開發(fā)、檢測(cè)試劑盒質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制，突破目前臨床疾病中血清抗體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制和應(yīng)用的瓶頸限制。

發(fā)明內(nèi)容