[發明專利]人源化IgG單克隆抗體標準物質及制備方法

有效

• 申請號: 202110259059.2
• 申請日: 2021-03-10
• 公開（公告）號: CN113004398B
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 米薇;戴新華;胡志上;彭濤;謝潔;翟睿;方向;歐陽艷艷
• 申請（專利權）人: 中國計量科學研究院
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;G01N33/577;G01N33/569;G01N33/68
• 代理公司: 北京東方尚禾專利代理事務所(特殊普通合伙) 11844
• 代理人: 李厚銘

1.一種人源化IgG單克隆抗體標準物質的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）針對病毒抗原進行噬菌體抗體庫篩選，獲得2種或2種以上達到親和力閾值需求的IgG原型抗體；所述抗體庫包括正常人天然庫、病人抗體庫、合成的人源抗體庫及免疫動物得到的抗體庫，庫容量在10⁹以上；所述原型抗體需針對抗原的不同表位；所述親和力閾值Kd10^-7；

（2）獲得人源化的IgG單克隆抗體：

A．如原型抗體來自于病人抗體庫、正常人天然抗體庫或合成的人源抗體庫，則獲得的目標抗體已經是人源的，符合制備要求；

B．如原型抗體來自于免疫動物得到的抗體庫或非人源合成抗體庫，則將原型抗體進行人源化改造獲得人源化的IgG單克隆抗體：

1）先利用人天然庫對抗體輕鏈進行鏈替換，將輕鏈置換成人源序列；

2）再用CDR移植技術將異源抗體CDR移植入人源IgG框架，對重鏈進行人源化；

（3）通過細胞培養表達、純化得到單克隆抗體的標準物質原料：單克隆抗體的標準物質原料的純度需≥95%；如果純度95%，則通過不影響抗體活性的方法對單克隆抗體進行純化，將純度提高到95%以上；所述不影響抗體活性的方法包括高效凝膠排阻色譜法、親和色譜法；

（4）對單克隆抗體進行純度表征；純度表征方法包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、高效凝膠排阻色譜法；

（5）對單克隆抗體進行蛋白質活性表征；活性表征方法包括酶聯免疫吸附法、表面等離子共振效價測定法、生物膜層干涉法；

（6）對單克隆抗體進行結構表征，結構表征信息包括單克隆抗體完整分子量測定、切去糖鏈后完整分子量測定、還原后分子量測定、切去糖鏈還原后分子量測定、糖基化修飾表征、肽譜表征；確定不同糖型的分布比例；根據單抗的完整分子量和單抗不同糖型修飾的分布比例，計算單抗蛋白的加權分子量；

進行單抗的肽譜分析，將單抗經酶切處理后經質譜儀進行檢測，通過軟件進行數據庫搜索對MS圖譜進行處理后得到肽圖序列覆蓋率；

通過胰蛋白酶、糜蛋白酶的多種酶切方式或者多次質譜分析提高肽譜的序列覆蓋率；肽圖的序列覆蓋率需達到90%以上；

（7）在純度表征和結構確證與目標抗體序列一致的基礎上，經均勻性、穩定性檢驗后，采用基于氨基酸分析的同位素稀釋質譜法對該單克隆抗體進行標準物質定值：對人源化IgG單克隆抗體標準物質進行均勻性檢驗，采用同位素稀釋質譜法進行測定，通過統計學方法分析確定標準物質是否均勻；對人源化IgG單克隆抗體標準物質進行穩定性檢驗，穩定性檢驗包括短期穩定性和長期穩定性，短期穩定性為模擬運輸條件下為期一周的穩定性考察，長期穩定性為-70℃儲存條件下6個月及以上的穩定性；

以亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸標準物質為標準，以同位素標記亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸為內標，采用同位素稀釋質譜法對人源化IgG單克隆抗體標準物質進行定值。

2.根據權利要求1所述的人源化IgG單克隆抗體標準物質的制備方法，其特征在于：所述步驟（2）A中，對篩選得到的人源抗體進行框架優化，即把CDR移植到高表達的框架上；可選的，對獲得的人源化IgG單克隆抗體進行體外親和力成熟；

所述步驟（2）B中，可選的，對獲得的人源化IgG單克隆抗體進行體外親和力成熟。