[發(fā)明專利]向非人脊椎動物導(dǎo)入編碼非人脊椎動物肽激素或細胞因子的裸DNA或RNA

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 99805215.9
• 申請日: 1999-04-15
• 公開（公告）號: CN1297481A
• 公開（公告）日: 2001-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: S·馬丁;P·F·羅素
• 申請（專利權(quán)）人: 法瑪西雅厄普約翰美國公司
• 主分類號: C12N15/26
• 分類號: C12N15/26;C12N15/24;C12N15/23;C12N15/25;C12N15/27;C12N15/62;A61K48/00
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標事務(wù)所
• 代理人: 樊衛(wèi)民

????????????????????發(fā)明背景

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及將編碼非人脊椎動物肽激素或細胞因子的裸DNA或RNA分子導(dǎo)入非人脊椎動物，以完成非人脊椎動物肽激素或細胞因子的遞送。本發(fā)明從而提供了直接給予目的多肽的一種替代方法。

相關(guān)技術(shù)

身體生長受到多種激素的影響，但是，主要的調(diào)節(jié)物是生長激素(GH)或促生長素(ST)。GH是以脈動方式從腦下垂體前葉腺分泌的。在人類中GH分泌主要發(fā)生在慢波睡眠的第三和第四階段。GH的分泌主要由下丘腦激素-生長激素釋放素(GHRH)和促生長素抑制素控制，它們分別提高和降低GH的分泌。在細胞質(zhì)中相當(dāng)量(10-50％)的GH結(jié)合到一個60kDa的結(jié)合蛋白上，該蛋白與GH細胞受體的胞外結(jié)合域相同。GH通過使其細胞受體二聚體化來作用于其靶組織，這相繼誘導(dǎo)生長調(diào)節(jié)素(主要是胰島素樣生長因子1型(IGF1))的產(chǎn)生。與GH類似，IGF結(jié)合至胞質(zhì)蛋白(主要是IGFBP3)，后者據(jù)認為能提高其循環(huán)半衰期。通過提高細胞增殖和氨基酸的保留，IGF能介導(dǎo)GH在靶組織中的許多合成代謝效應(yīng)。另外，IGF還對腦下垂體前葉產(chǎn)生負反饋從而抑制GH的進一步分泌。

對在人類(GH缺陷者)和動物(主要為肉用動物種類)上外源應(yīng)用GH的結(jié)果的描述與其合成代謝潛能是一致的。因此正常GH水平的提高導(dǎo)致骨生長和質(zhì)量的提高，瘦肉量的提高，以及脂肪組織的降低。在PNU已研究了給予重組豬生長激素(pST)或GHRH對豬的性能的效果，并已在文獻中報導(dǎo)。如果將足夠的GH連續(xù)給予生長期動物(例如，按天注射)，那么最終結(jié)果是瘦體重增加速率和效率的提高。如果將足夠的外源GH連續(xù)給予哺乳期奶牛(例如按天注射)，其產(chǎn)乳效果明顯表現(xiàn)為牛奶產(chǎn)量的提高。在引用的所有例子中，都需要在持續(xù)時期內(nèi)給予大量GH以便看到合成代謝或產(chǎn)乳效果。其一方面的原因是大量外源GH會導(dǎo)致GH級聯(lián)(促生長素抑制素和IGF1)的負效應(yīng)，從而減少垂體前葉產(chǎn)生的內(nèi)源GH。因此，所給外源GH必須不僅足夠取代由垂體前葉產(chǎn)生的常規(guī)GH日量，還要使GH水平高于動物中正常情況下存在的GH。

除了其合成代謝效應(yīng)，文獻中還報導(dǎo)過GH對免疫系統(tǒng)有積極效果。在淋巴細胞和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細胞中已鑒定到了GH和IGF受體。體外研究表明用GH和IGF-1進行刺激后，都能提升淋巴細胞的增殖。已證明GH是胸腺細胞成為成熟T淋巴細胞的關(guān)鍵因素，并能使動物在用脂多糖處理后免于內(nèi)毒素休克。

基因免疫接種是直接將細菌質(zhì)粒接種到哺乳動物宿主的組織中。當(dāng)這些細菌質(zhì)粒含有真核表達盒時，會表達基因產(chǎn)物，并產(chǎn)生幾種生物效應(yīng)之一。如果所編碼的基因產(chǎn)物對于宿主是異源的，表達帶來的一個后果是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。基因免疫接種已成功地用于誘導(dǎo)抗體以及針對多種潛在病原微生物的基因產(chǎn)物的細胞毒性T淋巴細胞應(yīng)答。表達產(chǎn)物的其他生物學(xué)后果取決于基因產(chǎn)物是否為激素的一個酶。那樣的話，表達產(chǎn)物會作用于宿主中存在的其正常生理目標。

少有對利用基因免疫接種來遞送生物活性分子的報導(dǎo)，但已描述過編碼激肽釋放酶的cDNA對血管高血壓的緩解作用。雖然經(jīng)基因免疫接種施用的質(zhì)粒DNA在宿主中保持時間長，但并未顯示出能在體內(nèi)表達顯著量的所編碼的基因產(chǎn)物。因此，在一個象GH級聯(lián)這樣的生物系統(tǒng)中，當(dāng)由于外源供應(yīng)(例如GH)而導(dǎo)致介導(dǎo)物水平提高時，造成生理產(chǎn)量下降，基因免疫接種也許不能產(chǎn)生足夠的蛋白質(zhì)來代替內(nèi)源水平并使其水平高于正常生理標準。

在過去幾年內(nèi)，全世界已有許多研究人員相當(dāng)成功地利用裸DNA(含有編碼目的蛋白質(zhì)的真核表達盒的細菌質(zhì)粒)來免疫動物。優(yōu)選的遞送技術(shù)是肌內(nèi)注射DNA溶液，或?qū)⒔痤w粒包裹DNA的轟擊遞送至動物的真皮內(nèi)。我們已初步成功地用編碼病毒糖蛋白、細胞因子或牛生長激素(bST)的裸DNA免疫接種了鼠或豬。但是，幾乎沒有國外研究人員或者我們自己也不能最終證明，通過這一機制遞送的細胞因子或生長激素能在宿主內(nèi)達到足夠高的血清水平，從而誘導(dǎo)適當(dāng)?shù)纳飸?yīng)答(例如由于外源生長激素造成的性能增強)。今年早先在豬中注射編碼bST的質(zhì)粒的實驗表明，產(chǎn)生了足夠的牛生長激素從而在約50％的免疫動物之血清中誘導(dǎo)出高滴度抗bST抗體。由于外源給予該蛋白質(zhì)造成內(nèi)源生長激素血清水平的少量提高，用足量粗蛋白質(zhì)喂養(yǎng)的豬生長率提高，我們決定利用一種已充分表征并且靈敏的生長篩選模型來確定肌內(nèi)(i.m.)注射裸質(zhì)粒pST-DNA是否能提高豬的平均日增重(ADG)和飼料利用率(FE)。