[發明專利]生產L-天冬氨酸的方法

無效

• 申請號: 99100744.1
• 申請日: 1999-02-12
• 公開（公告）號: CN1084389C
• 公開（公告）日: 2002-05-08
• 發明（設計）人: 向山正治;小松崎聡美
• 申請（專利權）人: 株式會社日本觸媒
• 主分類號: C12P13/20
• 分類號: C12P13/20
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 丁業平,王達佐

本發明涉及用具有高天冬氨酸酶活性的微生物生產L-天冬氨酸的方法。

用具有天冬氨酸酶活性的微生物大腸桿菌從富馬酸銨經酶促生產L-天冬氨酸的方法是已知的。日本專利公開55-35110(即JP-B-55-35110)描述了其中將大腸桿菌天冬氨酸酶固定于離子交換樹脂Duolite?A-7的方法。應用生物化學和生物技術(Applied?Biochemistry?and?Biotechnology)第13卷231-240頁(1986)描述了連續生產L-天冬氨酸的方法，其中反應器中裝有大腸桿菌，所述大腸桿菌通過凝膠包埋而被固定于κ角叉菜膠中。但是，從工業化生產的角度來看，這些方法是不令人滿意的，因為被固定化的天冬氨酸酶活性低，或者因為凝膠包埋固定會引起擴散障礙或使擴散速率受到限制。

由于傳統的固定化天冬氨酸酶沒有足夠高的活性，因此，需在30℃或更高的溫度完成反應，在反應中需要冷卻，因為天冬氨酸酶會因反應熱而損失了其活性。具體地說，在超過40℃時，活性顯著降低(AppliedMicrobiology?vol.27，No.5，878-885頁(1974)；Applied?Microbioloyg?vol.27，No.5，886-889頁(1974))。為了防止因反應熱而引起反應器中溫度的升高，需要給反應器安裝內部冷卻管或冷卻裝置例如夾套，這樣使反應器結構復雜。此外，由于現有技術中固定化天冬氨酸酶的活力低，因此，不能用所述天冬氨酸酶以高LHSV完成酶促反應。在使用通過凝膠包埋固定化的天冬氨酸酶的方法中，由于擴散障礙更大，也不可能以高LHSV(液體時空速)完成酶促反應。

需要以高LHSV完成反應以便提高利用固定化天冬氨酸酶的酶促反應生產L-天冬氨酸的生產率。利用在低溫具有足夠高的反應活性并且擴散障礙低和壓力損失小的固定化天冬氨酸酶可完成所述反應。令人遺憾的是，本領域尚未制備出所述固定化天冬氨酸酶。在這種情況下，本發明人現已制備出具有上述優良特性的固定化天冬氨酸酶，并已發現通過將底物溶液導入反應器中，同時將底物溶液的溫度控制在低于至少因反應熱引起的溫度升高而損害天冬氨酸酶穩定性的溫度，確保固定化天冬氨酸酶的穩定活性，則無需除去熱即可基本上以高LHSV完成反應。

本發明提供用于生產L-天冬氨酸的方法，該方法包括：固定含天冬氨酸酶的微生物細胞以產生固定化天冬氨酸酶；將富馬酸銨溶液加入裝有固定化天冬氨酸酶的反應器中；從反應混合物中回收產生的L-天冬氨酸，其中固定化天冬氨酸酶的活力為250U或更高，其中以2-35?LHSV的進料速率將富馬酸銨溶液加至反應器中。本文所用“1U”指每分鐘每毫升固定化酶產生1μmol?L-天冬氨酸，“LHSV”表示“液體時空速”并表示每體積催化劑(以毫升計)每小時的進料底物體積(以毫升計)。

本發明所用的固定化天冬氨酸酶例如是固定化的重組微生物細胞，所述微生物細胞含有利用重組DNA技術導入的天冬氨酸酶基因。用含天冬氨酸酶的上述微生物細胞和聚合物包被球形載體即可得到固定化天冬氨酸酶。具體地講，用與下列通式代表的聚合物混合的含天冬氨酸酶的上述微生物細胞包被球形苯乙烯二乙烯基苯共聚物型離子交換樹脂載體可得到固定化天冬氨酸酶：其中Y是直接鍵或由下列分子式代表的雙功能基團：

R₁和R₂各自獨立地是氫原子或有機殘基，X^是陰離子，n是100-5000的整數。

舉證性的有機殘基包括含有10個碳原子以下的烷基，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基和叔丁基，優選甲基。有機殘基可包括至少一個作為取代基的鹵素或羥基，例如4-氯-2-二甲基戊基，3-乙基-2，5-二氯庚基和2-羥基-3，5-二甲基壬基，優選3-氯-2-羥基丙基。

X^的實例包括鹵素離子如F^-、Cl^-、Br^-和I^-，優選Cl^-。也可用其他單價離子如NO₃^-作為X^。

通過上述固定方法固定上述含天冬氨酸酶基因的重組微生物細胞而得到的本發明固定化天冬氨酸酶有極高的活性并且壓力損失少以及擴散障礙小。結果，與傳統固定化天冬氨酸酶不同，利用本發明的固定化天冬氨酸酶可以以高LHSV完成酶促反應。

由于可將低溫富馬酸銨溶液加至反應中，所以天冬氨酸酶的壽命得到延長。