[發(fā)明專利]構(gòu)建多功能基因工程菌生產(chǎn)聚β－羥基丁酸酯的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 99100577.5
• 申請日: 1999-02-04
• 公開（公告）號: CN1086203C
• 公開（公告）日: 2002-06-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈忠耀;于慧敏;李紅旗
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號: C12P7/62
• 分類號: C12P7/62;C07C67/00;C07C69/675
• 代理公司: 北京清亦華專利事務(wù)所
• 代理人: 羅文群

1、一種構(gòu)建多功能基因工程菌生產(chǎn)聚β-羥基丁酸酯的方法，其特征在于，該方法由以下步驟組成：

(1)、首先采用分子克隆操作制備大腸桿菌和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的感受態(tài)細(xì)胞：從菌體的固體平板上挑取單菌落，接種于裝有3-10毫升的LB液體培養(yǎng)基的試管中，液體培養(yǎng)基的組成為：酵母浸膏粉：5g/L，蛋白胨：10g/L，氯化鈉：10/gL，pH7.0，在25-38℃的溫度下于150-300轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)6-15小時(shí)；取0.1-1.0毫升培養(yǎng)液接種于裝有50-100毫升LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在25-38℃的溫度下于150-300轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)至吸光度OD₆₀₀為0.3-1.0；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入預(yù)冷的已滅菌離心管中，冰浴冷卻5-20分鐘后于2-6℃的離心機(jī)上以3000-8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5-20分鐘；倒出培養(yǎng)液，在無菌條件下將管倒置1-3分鐘以使殘留的培養(yǎng)液流盡；加5-25毫升用冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl₂重懸每份沉淀，冰浴放置5-25分鐘；于2-6℃的離心機(jī)上以3000-8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5-20分鐘，棄上清；用1-5毫升用冰預(yù)冷過的0.1mol/L?CaCl₂再次重懸每份沉淀，最后在冰上放置片刻即得到感受態(tài)細(xì)胞，將制好的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到已滅菌的1.5毫升離心管中，每管100-500微升；

(2)、在第一步制備好的感受態(tài)細(xì)胞中加入體積小于10微升、質(zhì)量小于50納克的攜帶透明顫菌血紅蛋白基因的質(zhì)粒pBR322-vgb，進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：混勻內(nèi)容物，在冰上放置10-50分鐘；接下來在42℃的循環(huán)水浴中，放置30-150秒，再冰浴1-10分鐘后，每管加入0.5-5毫升的LB培養(yǎng)基，在25-38℃水浴或培養(yǎng)箱中溫浴20-120分鐘，將50-200微升已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布到含有相應(yīng)抗生素的LB固體平板上，將平板置于室溫下直至液體被吸收，倒置平板，于25-38℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-30小時(shí)后，即出現(xiàn)重組菌的菌落，完成質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化；

(3)、從轉(zhuǎn)化后的重組大腸桿菌E.coli?JM105-pBR322-vgb的固體平板上挑取單菌落，接種于裝有1-10毫升的LB液體培養(yǎng)基的試管中，在25-38℃的溫度下于150-300轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)6-15小時(shí)；對收獲的菌體采用試劑盒法提取并純化其中的質(zhì)粒pBR322-vgb，從而得到擴(kuò)增的含透明顫菌血紅蛋白基因的質(zhì)粒pBR322-vgb；

(4)、采用限制性核酸內(nèi)切酶對質(zhì)粒pBR322-vgb進(jìn)行透明顫菌血紅蛋白基因片段的酶切分離，酶切溫度為25-38℃，時(shí)間為1-5小時(shí)，酶切后的vgb片段用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳回收；

(5)、將酶切收獲的透明顫菌血紅蛋白基因與PHB合成基因及λ噬菌體裂解基因采用常規(guī)克隆操作進(jìn)行基因重組，并引入宿主大腸桿菌和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌中，構(gòu)建多功能基因工程菌；

(6)、在含葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中對新構(gòu)建的基因工程菌進(jìn)行培養(yǎng)：種子液為試管培養(yǎng)液，接種量為1％-10％，培養(yǎng)基體積為30-100毫升，pH6.0-8.0，搖床轉(zhuǎn)速為150-300轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)溫度為35-38℃，當(dāng)細(xì)胞生長約24-36小時(shí)后，用離心機(jī)以4000-8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速，離心10-20分鐘，棄上清液，收獲離心后的細(xì)胞；

(7)、用紫外照射、電擊、凍融中的任何一種物理方法或乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液和氯仿等化學(xué)試劑誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，釋放出胞內(nèi)的聚β-羥基丁酸酯，菌懸液在離心機(jī)上以4000-8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10-20分鐘，收集沉淀，于60-80℃烘箱中烘干24-48小時(shí)，即獲得本發(fā)明的產(chǎn)品聚β-羥基丁酸酯。