[發明專利]酒曲霉菌中蛋白水解酶的增強表達

無效

• 申請號: 98801287.1
• 申請日: 1998-05-01
• 公開（公告）號: CN1237205A
• 公開（公告）日: 1999-12-01
• 發明（設計）人: P·范登布勒克;M·阿福爾特
• 申請（專利權）人: 雀巢制品公司
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N1/15;C07K14/38;C12N9/62;A23J3/16;A23J3/18;C12P21/06
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 羅宏,齊曾度

本發明涉及可增強表達蛋白水解酶的酒曲霉菌的遺傳突變。

領域闡述

水解的蛋白，廣泛用于食品工業，可通過用酸，堿或酶水解蛋白原料得到。多種方法用酒曲霉菌(koji?mold)制備食品產品，通過很多種分泌淀粉酶，蛋白酶和肽酶的作用水解。酒曲霉菌傳統把是那些用于生產包括以下種屬的細胞的酒曲培養物(US4308284)，例如，曲霉屬，根酶屬和/或主酶屬的細胞，特別是醬油曲霉，米曲霉，海棗曲霉，黑曲霉，泡盛曲霉，米根霉，寡孢根霉，日本根霉，臺灣根霉，卷枝毛霉，日本毛霉，灰綠青霉，和褐色青霉。根據International?Code?ofBotanical?Nomenclature(ICBN)，的規則，曲霉屬(Aspergillus)是風媒屬。這意味著真正的曲霉只通過分身孢子無性繁殖。然而，典型的曲霉分身孢子形態學可在能通過子囊孢子有性繁殖的真菌中發現。有些曲霉分類學家引起混亂，由于他們不同意ICBN術語。他們試圖修正分類方案以將米曲霉(米曲霉)包括在此屬內，盡管其分類修正名稱是Emericella?nidulans?(Samson,Aspergillus，生物學和工業應用，355-390頁，Bennett和klich編，Boston)。

EP417481(Societe?des?Produits?Nestle)這樣描述發酵的黃豆調味劑的生產過程，其中通過混合酒曲培養物和蒸煮黃豆和烹熟的小麥的混合物制備酒曲，酒曲接著在酒曲培養物發酵時產生的酶存在的水懸液中45℃到60℃水解3到8小時，通過在水解的酒曲懸濁液中加入氯化鈉制備moromi,moromi留作發酵并被擠壓且獲得的溶液用巴氏法消毒并澄清。

EP429760(Societe?des?Produits?Nestle)描述了生產調味劑的過程，其中制備富含蛋白材料的水懸液，蛋白通過蛋白酶在pH6.0到11.0水解溶液得到，懸液在pH4.5到6.5熱處理，且用酒曲培養物的酶催熟懸液。

類似的，EP96201923.8(Societe?des?Produits?Nestle)描述了生產肉調味劑的過程，其中制備含有植物蛋白源和植物碳水化合物源的混合物，所述混合物含有至少45％的干物質，混合物用酒曲培養物接種且用一種或多種其它傳統肉類發酵所涉及的微生物，混合物被接種直到形成肉味。

然而，另一方面，酸或堿水解會破壞水解中產生的必需氨基酸降低營養價值，而酶水解很少徹底，這樣水解蛋白便含有確實量的多肽。酒曲過程的優化和進一步發展被關于水解酶本身，其調節和任何影響其表達和活性的過程因子(例如溫度，pH，水活性，和鹽濃度)的知識的缺乏所阻礙。

在真菌Emericella?nidulans(katz等，基因，150,287-292,1994)中，發酵活性歸因于至少三條基本控制路線包括碳代謝產物阻遏，氮和硫代謝阻遏。這三條調節路線使底物中的氮，碳，和硫源依照其氮，能量，硫供應依次被利用。在Emericella?nidulans(Arst等分子基因遺傳，26,111-141,1973)，氮代謝阻遏由areA基因產物實現，或在其它真菌中Neurospora?crassa(DAvies等，美國國家科學院院刊，84,3753-3757,1987),Penicillium?chrysogenum(Haas等，遺傳學現狀，27,150-158,1995)和啤酒酵母(Minehart等，分子細胞生物學，11,6216-6228,1991)類似基因實施類似功能。

areA基因編碼正調節作用DNA結合蛋白(AREA)，屬于轉錄因子GATA家族，為在利用除氨和L-谷氨酰胺以外的氮源時所必需。在氮脫阻遏條件下，通過細胞內高水平谷氨酰胺的信號，areA表達通過三條機制下調：1)AREA蛋白失活，2)areA轉錄終止和3)通過3’非翻譯尾序列(3’-UTS)的功能，areA?mRNA降解增強(Platt等，EMBO?J,15,2791-2801,1996)。缺乏功能性AREA蛋白時，只有氨和L-谷氨酰胺可用作氮源，同樣的，無功能areA突變只有氨和L-谷氨酰胺可用作氮源(Arst等，1973)。

對酒曲發酵的觀察提示氮代謝阻遏是酒曲發酵的主要因素。例如，高水平的L-谷氨酰胺顯示可以負性影響酒曲發酵的蛋白水解活性。