[發明專利]合成編碼雪花蓮凝集素的抗同翅目害蟲基因及其應用

有效

• 申請號: 98120233.0
• 申請日: 1998-10-06
• 公開（公告）號: CN1073623C
• 公開（公告）日: 2001-10-24
• 發明（設計）人: 郭三堆
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/63;C12N15/82;A01H1/00
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本發明涉及人工合成的編碼雪花蓮凝集素的基因，包含所說基因的融臺基因構建體，攜帶該構建體的新的重組表達載體，被所說的表達載體轉化的植物細胞，以及由所說的細胞產生的對害蟲，尤其是對同翅目害蟲表現有殺蟲性的轉基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。

近年來在抗蟲植物基因工程研究領域，有關凝集素的研究逐漸引起了科學家們的重視。一般說來，凝集素是一類可逆的結合特異單糖或寡糖的蛋白質，部分具有殺蟲作用。凝集素早期的定義“lectin”來源于拉丁文“legere”，意思是選擇，以強調其能選擇性地與糖復合物相結合的特性。后來由于lectin被廣泛應用于表現出更廣泛凝集行為的所有蛋白質，故“lectin”已失去早期選擇的意思，而另一個名字“agglutinin”作為lectin的同義詞，能更準確地反映這類蛋白質的特性，因為它是指能通過與細胞表面結合碳水化合物的特異性結合而使細胞凝集的所有蛋白質。由于植物凝集素家族成員的增加，對其結構、功能研究的深入以及分子生物學水平上新的發現，使得植物凝集素的定義幾經修正。最近Peumans和Van?Damme(Plant?Physiology,109:347～352,1995)認為凝集素(lectin)的定義應為：含有至少一個非催化結構域并能可逆結合到特異單糖或寡糖上的蛋白質總稱。

關于凝集素的殺蟲機理，目前一般認為外源凝集素進入昆蟲消化道后，與腸道圍食膜細胞表面的糖蛋白結合，降低膜的通透性，從而影響營養物質的正常吸收。此外，這種結合還可能在昆蟲的消化道內誘發病灶，引起消化道內細菌和病毒的繁殖等，從而對昆蟲本身造成危害(Eisemann?C.H.,et?al.Entomologia?Experimental?etApplicata.72:1～10,1994)。

雪花蓮凝集素(Galanthus?Nivalis?Agglutinin，以下均簡稱GNA)是石蒜科(Amaryllidaceae)的一種名為雪花蓮的植物體內存在的一種植物凝集素。Van?Damme等人(Planta?Vol?186:35～43,1991；European?Journal?of?Biochemistry?Vol?202:23～30,1991)發現GNA是由多基因家族編碼的。它的殺蟲效果較好，對具有刺吸式口器的害蟲如蚜蟲、稻飛虱、葉蟬等具有較好抗性，對咀嚼式害蟲也具有中等抗性。另外由于GNA只專一識別并結合α-1,3和α-1,6甘露糖(Van?Damme?Els?J.M.,etc.FEBS?Letters.Vol215:140～144,1987)，而人及絕大多數動物細胞表面甘露糖殘基很少，所以GNA對人畜幾乎無害。是目前所知的最適于轉基因植物研究的植物凝集素之一。

Annick?Barre,Van?damme等人(Plant?Physiology,112:1511～1540,1996)通過SDS-PAGE以及蔗糖密度梯度離心證明GNA分子是每個亞基約為12.5KD的四聚體蛋白，且蛋白質分子沒有被糖基化。GNA分子的三維結構相當于一個由四條β折疊片(亞結構域)通過Ω環連成的一個β折疊桶。每個凝集素單體有3個相同的由四個氨基酸殘基組成的甘露糖結合位點。四個GNA單體構成一個具有充分暴露的結合甘露糖位點的四聚體。

1995年Powell等人(Entomologia?Experimental?et?Applicata.75:51～59,1995)以GNA和麥胚凝集素(WGA)分別按0.1％(w/v)的濃度加入到人工飼料中飼喂稻褐飛虱，結果發現GNA的抗性效果較好，24小時內所測試稻褐飛虱蜜汁分泌降低達96％。1996年Nicolas?Sauvion等人(Entomologia?Experimental?et?Applicata.79:285～293,1996)以濃度為30uM的GNA人工飼喂桃蚜，幼蟲死亡率為42％。