[發(fā)明專利]合成編碼雪花蓮凝集素的抗同翅目害蟲基因及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 98120233.0
• 申請日: 1998-10-06
• 公開（公告）號: CN1073623C
• 公開（公告）日: 2001-10-24
• 發(fā)明（設計）人: 郭三堆
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/63;C12N15/82;A01H1/00
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本發(fā)明涉及人工合成的編碼雪花蓮凝集素的基因，包含所說基因的融臺基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達載體，被所說的表達載體轉(zhuǎn)化的植物細胞，以及由所說的細胞產(chǎn)生的對害蟲，尤其是對同翅目害蟲表現(xiàn)有殺蟲性的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。

近年來在抗蟲植物基因工程研究領(lǐng)域，有關(guān)凝集素的研究逐漸引起了科學家們的重視。一般說來，凝集素是一類可逆的結(jié)合特異單糖或寡糖的蛋白質(zhì)，部分具有殺蟲作用。凝集素早期的定義“l(fā)ectin”來源于拉丁文“l(fā)egere”，意思是選擇，以強調(diào)其能選擇性地與糖復合物相結(jié)合的特性。后來由于lectin被廣泛應用于表現(xiàn)出更廣泛凝集行為的所有蛋白質(zhì)，故“l(fā)ectin”已失去早期選擇的意思，而另一個名字“agglutinin”作為lectin的同義詞，能更準確地反映這類蛋白質(zhì)的特性，因為它是指能通過與細胞表面結(jié)合碳水化合物的特異性結(jié)合而使細胞凝集的所有蛋白質(zhì)。由于植物凝集素家族成員的增加，對其結(jié)構(gòu)、功能研究的深入以及分子生物學水平上新的發(fā)現(xiàn)，使得植物凝集素的定義幾經(jīng)修正。最近Peumans和Van?Damme(Plant?Physiology,109:347～352,1995)認為凝集素(lectin)的定義應為：含有至少一個非催化結(jié)構(gòu)域并能可逆結(jié)合到特異單糖或寡糖上的蛋白質(zhì)總稱。

關(guān)于凝集素的殺蟲機理，目前一般認為外源凝集素進入昆蟲消化道后，與腸道圍食膜細胞表面的糖蛋白結(jié)合，降低膜的通透性，從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收。此外，這種結(jié)合還可能在昆蟲的消化道內(nèi)誘發(fā)病灶，引起消化道內(nèi)細菌和病毒的繁殖等，從而對昆蟲本身造成危害(Eisemann?C.H.,et?al.Entomologia?Experimental?etApplicata.72:1～10,1994)。

雪花蓮凝集素(Galanthus?Nivalis?Agglutinin，以下均簡稱GNA)是石蒜科(Amaryllidaceae)的一種名為雪花蓮的植物體內(nèi)存在的一種植物凝集素。Van?Damme等人(Planta?Vol?186:35～43,1991；European?Journal?of?Biochemistry?Vol?202:23～30,1991)發(fā)現(xiàn)GNA是由多基因家族編碼的。它的殺蟲效果較好，對具有刺吸式口器的害蟲如蚜蟲、稻飛虱、葉蟬等具有較好抗性，對咀嚼式害蟲也具有中等抗性。另外由于GNA只專一識別并結(jié)合α-1,3和α-1,6甘露糖(Van?Damme?Els?J.M.,etc.FEBS?Letters.Vol215:140～144,1987)，而人及絕大多數(shù)動物細胞表面甘露糖殘基很少，所以GNA對人畜幾乎無害。是目前所知的最適于轉(zhuǎn)基因植物研究的植物凝集素之一。

Annick?Barre,Van?damme等人(Plant?Physiology,112:1511～1540,1996)通過SDS-PAGE以及蔗糖密度梯度離心證明GNA分子是每個亞基約為12.5KD的四聚體蛋白，且蛋白質(zhì)分子沒有被糖基化。GNA分子的三維結(jié)構(gòu)相當于一個由四條β折疊片(亞結(jié)構(gòu)域)通過Ω環(huán)連成的一個β折疊桶。每個凝集素單體有3個相同的由四個氨基酸殘基組成的甘露糖結(jié)合位點。四個GNA單體構(gòu)成一個具有充分暴露的結(jié)合甘露糖位點的四聚體。

1995年P(guān)owell等人(Entomologia?Experimental?et?Applicata.75:51～59,1995)以GNA和麥胚凝集素(WGA)分別按0.1％(w/v)的濃度加入到人工飼料中飼喂稻褐飛虱，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GNA的抗性效果較好，24小時內(nèi)所測試稻褐飛虱蜜汁分泌降低達96％。1996年Nicolas?Sauvion等人(Entomologia?Experimental?et?Applicata.79:285～293,1996)以濃度為30uM的GNA人工飼喂桃蚜，幼蟲死亡率為42％。