[發明專利]高甜度莫奈靈DNA序列及高效表達所述DNA序列的方法

無效

• 申請號: 98102420.3
• 申請日: 1998-06-12
• 公開（公告）號: CN1062015C
• 公開（公告）日: 2001-02-14
• 發明（設計）人: 郭三堆;李敏
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N1/21;C12N15/70
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了采用基因工程技術提高莫奈靈(monellin)甜度和發酵生產高甜度莫奈靈([Asn⁶⁶]monellin)的方法及其應用。

本發明還提供了人工合成編碼高甜度莫奈靈的基因，以及攜帶該基因的表達載體和含有表達載體的重組細胞，及其由重組細胞高效生產的高甜度莫奈靈蛋白及其應用。

莫奈靈甜蛋白來源于西非一種熱帶植物(Dioscorephyllum?cumminsii)的果實(Morris，J.A.，Cagan，R.H.，Biochim.Biophys.Acta，261：114-122，1972)，是一種天然蛋白質甜味劑。莫奈靈甜蛋白在許多方面優于蔗糖和其他甜味劑：(1)莫奈靈不含碳水化合物(Morris，J.A.，The?Journal?of?Biological?Chemistry，241(2)：534-539，1973)，代謝產生的熱量低。(2)莫奈靈甜度高，按重量比其甜度是蔗糖的3000倍，按分子比計算則為蔗糖的10萬倍(Kim，S.H.，deVos，A.M.，Trends?in?Biochem.Sci.13：13-15，1988)，是現有甜味劑中甜度最高的一種。(3)莫奈靈是天然蛋白質，富含多種氨基酸(Morris，J.A.，TheJournal?of?Biological?Chemistry，241(2)：534-539，1973)，營養豐富，因對人體無任何毒副作用，不僅老幼正常人可直接食用，而且糖尿病人、肥胖病人、心腦血管病人和兒童齲齒病人皆可直接食用。(4)莫奈靈對細菌作用的穩定性高，不會導致齲齒。(5)莫奈靈是一種增香劑，尤其對天然香料，效果更明顯。在食品、飲料、醫療保健等方面有廣泛的應用前景，是一種很有前途的甜味劑。

但作為莫奈靈天然來源的植物正常結實所要求的生態環境非?？量?，很難在其他地區引種成功；另外，天然莫奈靈由A、B兩條多肽鏈組成，穩定性較差，低pH或高溫條件下，A、B兩條多肽鏈易分開，而失去甜味活性。生物工程技術的迅速發展啟發人們用基因工程的手段去改造和開發莫奈靈，實現其在生產和生活中的廣泛應用。

1989年，Kim等人用一小段DNA序列將編碼A、B鏈的基因連接起來，并使其成功的在大腸桿菌中表達，單鏈莫奈靈(single?monellin)與天然莫奈靈相比，兩者甜度接近，但前者穩定性和復性能力較后者都有顯著提高(United?States?Patent?5264558)。1992年，Penanubia等得到轉單鏈莫奈靈基因的番茄和萵苣，但莫奈靈表達效率較低(Penarrubia，L.，Kim，R.，Giovannoni，J.，Bio/Technology?10：561-564，1992)。1995年，郭三堆等采用原核生物偏愛密碼子合成單鏈莫奈靈基因，使其在大腸桿菌中得到高效表達，莫奈靈達菌體可溶性蛋白的20％，表達效率較低。1996年，Kondo.K.等使單鏈莫奈靈基因在酵母(Candida?utilis)中表達，表達效率高達50％(Kondo，K.，Miura，Y.，Sone，H.，NatureBiotechnology?15：453-457，1997)，為莫奈靈的規模生產和應用創造了條件。以上所涉及的人工改造的莫奈靈基因產物，甜度均為蔗糖重量甜度的3000倍。本發明人工合成的高甜度莫奈靈基因產物是蔗糖重量甜度的4500倍，在蛋白質結構上與上述人工改造的莫奈靈有所不同。

1990-1992年間，Kohmura對天然莫奈靈的結構和功能進行研究，用固定相合成法分別Asn²⁶monellin甜度與天然莫奈靈相比，分別由原來蔗糖重量甜度的3000倍提高到了5500倍和7500倍(Kohmura，M.，Nio，N.，Ariyoshi，Y.，BioSci.Biotech.Biochem.，56(3)：472-476，1992)，由此可見，用固相合成法可以得到高甜度莫奈靈，但這種方法與本發明在細菌中生產高甜度莫奈靈的方法相比較成本太高。

本發明的目的是在前人工作的基礎上，不僅要提高莫奈靈蛋白的甜度，同時要建立一種簡便、快速、可大規模生產廉價高甜度莫奈靈的方法及其產物的應用。

本發明提供的高甜度莫奈靈蛋白，將天然莫奈靈的A鏈和B鏈合并成一條單鏈，其間加入了具有彈性彎曲特性的氨基酸，并將第66位Asp設計為Asn，從而既維持了與天然莫奈靈相似的空間結構，又提高了所表達甜蛋白的效率、穩定性和甜度。