[發(fā)明專利]桿狀病毒全期啟動(dòng)子盒及含該全期啟動(dòng)子盒的載體系統(tǒng)

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 97114311.0
• 申請(qǐng)日: 1997-11-24
• 公開（公告）號(hào): CN1188805A
• 公開（公告）日: 1998-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王珣章;龍綮新;吳文言;曲士芮;龐義
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/33
• 分類號(hào): C12N15/33;C12N15/63
• 代理公司: 中山大學(xué)專利事務(wù)所
• 代理人: 林燦志

本發(fā)明屬于昆蟲桿狀病毒的基因工程，具體涉及桿狀病毒的全期啟動(dòng)子盒及含有該全期啟動(dòng)子盒的桿狀病毒載體系統(tǒng)。

桿狀病毒載體系統(tǒng)的建立和發(fā)展，是80年代真核基因表達(dá)研究領(lǐng)域的重大進(jìn)展之一(Luckow?&?Summers?1988?Trends?in?the?development?of?baculovirusexpression?vectors?Bio/technology?6：47-55)。與細(xì)菌、酵母細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，這種無(wú)脊椎動(dòng)物表達(dá)載休的最大優(yōu)點(diǎn)是能高效(100-500mg/L)而廣泛地表達(dá)外源基因產(chǎn)物。由于具有翻譯后修飾加工系統(tǒng)，表達(dá)產(chǎn)物在大多數(shù)情況下，其抗原性、免疫原性和其它生物學(xué)功能都與天然蛋白質(zhì)非常相似。因此，較高等的真核細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾、剪接及輸送可在該表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，這對(duì)于重組蛋白質(zhì)是否具有生物學(xué)功能是必須的。此外，桿狀病毒對(duì)脊椎動(dòng)物或植物無(wú)致病性，使用安全。與哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)不同，該系統(tǒng)無(wú)需用轉(zhuǎn)化細(xì)胞或轉(zhuǎn)化因子，操作更簡(jiǎn)便(O’Reilly，et?al.1994?Baculovirus?expression?vectors?A?laboratorymanual?New?York，WH?Freeman)。

常規(guī)的桿狀病毒載體系統(tǒng)是建立在病毒復(fù)制最晚期高效表達(dá)的多角休(polh)基因可被外源基因取代這一基礎(chǔ)上的。自Smith等1983年重組出第一個(gè)缺失多角體蛋白基因的苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa?californicanuclear?polyhedrosis?virus，AcNPV)以來(lái)，許多實(shí)驗(yàn)室相繼構(gòu)建了各種能取代AcNPV多角體蛋白基因的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒。其主要策略是利用多角體(polh)基因的強(qiáng)啟動(dòng)子及其它一些基因元件，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)同源重組，將外源基因片段引入野生型桿狀病毒基因組，產(chǎn)生重組病毒，經(jīng)過(guò)一系列的空斑篩選、純化得到重組病毒。這條路線已相當(dāng)成熟，且一直沿用至今，而近幾年發(fā)展起來(lái)的幾種新策略，極大地提高了重組效率，如線性化桿狀病毒基因組(Kitts，et?al.1990.Linearzation?ofbaculovirus?DNA?enhances?the?recovery?of?recombinant?virus?expression?vectors.NuclAcids?Res?18：5667；Kitts，et?al.1993?A?method?for?producing?recombinant?baculoviruscxpression?vectors?at?high?frequency.Biotechniques?14：810-817)：釀酒酵母中YAC介導(dǎo)的重組(Patel，et?al.1992.A?new?method?for?the?isolation?of?recombinantbaculovirus.Nucl?Acids?Res?20：97-104)；大腸桿菌內(nèi)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的重組(Luckow，et?al.1993.Efficient?genaration?of?infections?recombinant?baculovirus?by?site-specifictransporson-midiated?insertion?of?foreign?genes?into?a?baculovirus?genome?propagated?inE.coli.J?Virol?67：4566-4579)，以及體外位點(diǎn)特異重組等。上述各種用于操縱桿狀病毒的策略，其共同之處是破壞了桿狀病毒polh基因，重組病毒不能形成多角體(OCC)，因而在利用昆蟲蟲體表達(dá)外源基因方面顯得極為不便(必須通過(guò)注射來(lái)感染蟲體)。研究結(jié)果表明，在保留全部病毒基因的情況下，僅將另一拷貝啟動(dòng)子及與之相連的外源基因片段插入到polh基因或p10基因附近，由此構(gòu)建的轉(zhuǎn)移載體也能把外源基因重組至桿狀病毒基因組中，并獲得良好的表達(dá)效果(王珣章等，1991，形成多角體的桿狀病毒載體系統(tǒng)的建立。病毒學(xué)報(bào)7：253-261；王珣章等，1992，人工合成桿狀病毒后期啟動(dòng)子的探討。中國(guó)科學(xué)(B輯)1：39-46：龍綮新等，1991，乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆蟲體系中的表達(dá)。生物工程學(xué)報(bào)7：37-46)。本實(shí)驗(yàn)室曾首次探討了人工合成模擬桿狀病毒后期啟動(dòng)子的方法，建立了既保留傳統(tǒng)高效表達(dá)外源基因的特點(diǎn)、又形成多角體的重組桿狀病毒體系(王珣章等，1991，形成多角體的桿狀病毒載體系統(tǒng)的建立。病毒學(xué)報(bào)7：253-261：王珣章等，1992，人工合成桿狀病毒后期啟動(dòng)子的探討。中國(guó)科學(xué)(B輯)1：39-46)。此系統(tǒng)除可用作表達(dá)載體(可經(jīng)口服大規(guī)模感染昆蟲，免去注射感染蟲體的麻煩)外，還因能形成多角體，可用于新型病毒基因工程殺蟲劑的研制。