[發明專利]DNA序列

無效

• 申請號: 96192382.2
• 申請日: 1996-02-09
• 公開（公告）號: CN1177981A
• 公開（公告）日: 1998-04-01
• 發明（設計）人: A·R·斯拉巴斯;A·P·布朗;C·L·布羅夫;J·T·M·克羅恩
• 申請（專利權）人: 吉恩·希爾斯有限公司
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/82;A01H5/00;C11B1/00
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 李瑛

本發明涉及修飾的植物。更具體地說，本發明涉及以使得植物至少一部分(例如該植物的種子)能夠產生商業上有用的油脂(oil)的方式修飾的植物。

長期以來，植物一直是商業上有價值的油脂源。植物來源的油脂之營養用途迄今為止一直占統治地位，但是目前注意力又轉移到工業用油脂源的植物上，如代替或改進礦物油脂。油料種子(如蕓苔)中含有各種脂類(Hildish和Williams，“天然脂類的化學組成”，Chapman?Hall，倫敦，1964)。對通過利用重組DNA技術改變脂類組分存在大量興趣(如Knauf，TIB?tech，1987年2月，40-47)，但到目前為止，盡管這種技術的復雜性一直在增加，但由于各種原因，這種技術絕不可能實現所有的目標。

制作植物來源之油脂的脂類成分的成功要求扎實地理解相關的生物化學和基因的知識。廣義來講，這兩個方面是可以達到的。首先，可以修飾植物以便使對這種植物來說是新的的脂肪酸合成，這樣，例如，可以在蕓苔中合成月桂酸和/或硬脂酸。此外，可以改變脂肪酸在脂類的甘油骨架上的摻入模式和/或者程度。本發明涉及的是后一方面。

通過一序列酰基轉移酶將脂肪酸部分加入到甘油骨架上而在植物中形成脂類。在甘油分子上存在可以取代脂肪酸(酰基)部分的三個位置，每個位置的取代通過位置特異性酶催化完成。這些酶是甘油-sn-3-磷酸鹽酰基轉移酶(1-酰基轉移酶)、1-酰基-sn-甘油-3-磷酸鹽酰基轉移酶(2-酰基轉移酶)和sn-1，2-二酰甘油酰基轉移酶(3-酰基轉移酶)。

當前，植物中“脂類工程”的一個(但不是唯一的)目標是提供包括具有高含量順芥子酸脂類的油和/或包含三芥酸精(trierucin)油脂。包含順芥子酸脂類由于各種目的商業上希望得到，特別是在一定的情況下作為礦物油的代替品或補充，這一點上文已提及。就油料種子蕓苔(Brassica?napus)來說(當今栽培中產生油脂最重要的作物之一)，2-酰基轉移酶的特異性能絕對區分2位上摻入的順芥子酸。這樣，既使是這些蕓苔的栽培品種能夠在1位和3位上摻入順芥子酸，對順芥子酸也沒區別(至少是減少)，只有最多66％摻入到三酰基甘油中的脂肪酸可以是順芥子酸。已知這種品種是HEAR(高順芥子酸蕓苔)變種。

因此希望產生這樣的植物，即常規的油料種子蕓苔以及HEAR品種，這種植物含有有用水平的三芥酸精和/或含有高水平的順芥子酸和/或含有在2位摻入的順芥子酸的油脂；同樣的油脂是其它植物油料(oil)作物的油脂，如玉米、向日葵和大豆等等，僅列出幾例。而原則上認為將編碼不同脂肪酸特異性的2-酰基轉移酶的DNA引入(例如，從一種不同的植物中)到需要的植物中是可能的，但在實施上存在很多問題。

形成三酰甘油的酰化作用途徑所有相關的酶都是膜結合的。有1-酰基轉移酶、2-酰基轉移酶、3-酰基轉移酶，它們存在于細胞質的內質網中。還沒有純化它們。這使得對它們的操作很困難，并不能使用很多常規的DNA克隆方法。奇怪的是，在克隆編碼可溶性的Choroplasticl-酰基轉移酶的基因(或至少是cDNA)時不存在這種困難。事實上，為一個完全不同的目的，一直在進行有關這個酶的重組DNA工作，即Murata等(自然356710-713(1992))進行的提高煙草植物葉片抗寒性的工作。

Welter等在脂肪科學技術，93，No?8：288-89(1991)中提出克隆膜結合酶(如2-酰基轉移酶)的策略，盡管沒有給出范例。

WO-9413814公開了一種2-酰基轉移酶的DNA序列(和相應的蛋白質序列)。這種來自玉米的序列用于轉化植物，改變了該植物2-酰基轉移酶正常的底物特異性。該公開內容也包括來源于玉米2-AT的cDNA序列用于定位來源于蕓苔屬和菜屬(Limnanthes)物種的高度同源性的2-ATs。

目前已經驚奇地發現，事實上在菜屬中存在另一種在蕓苔中沒有同系物且是種子特異性的2-AT。這種2-AT能夠在2-位上摻入順芥子酸，這種情況，例如在蕓苔天然的2-AT中是不存在的。

因此，本發明的第一個方面提供了重組的或分離的DNA序列，這種序列編碼一種具有膜結合的(membrane-bound)2-酰基轉移酶活性的酶，這些序列選自：

(i)DNA序列，這種序列包含圖3的DNA序列或其互補鏈；

(ii)核酸序列，這種核酸序列在嚴格條件下能和圖3的DNA序列或其互補鏈雜交；

(iii)核酸序列，這種核酸序列在沒有遺傳密碼的簡并性時能和圖3的DNA序列或其互補鏈雜交。