[發(fā)明專利]非放射性細(xì)胞增殖測(cè)定試劑及其配制方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 96119052.3
• 申請(qǐng)日: 1996-04-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN1162019A
• 公開(kāi)（公告）日: 1997-10-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖定璋
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/04
• 分類號(hào): C12Q1/04;C12Q1/32
• 代理公司: 廣東專利事務(wù)所
• 代理人: 劉媖

本發(fā)明涉及一種用于細(xì)胞增殖測(cè)定的組合物。

細(xì)胞增殖測(cè)定在組織細(xì)胞培養(yǎng)研究中必不可少。近來(lái)年更廣泛用于細(xì)胞生物學(xué)中各種多肽生長(zhǎng)因子、調(diào)節(jié)因子、抑制因子以及細(xì)胞毒素等生物活性的測(cè)定中，細(xì)胞增殖測(cè)定方法在應(yīng)用中不斷改進(jìn)。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)、外有關(guān)實(shí)驗(yàn)室廣泛采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量酶反應(yīng)法測(cè)定細(xì)胞增殖，該方法由Mosmann等于1983年創(chuàng)立。主要原理是活細(xì)胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶能催化淡黃色的四甲基偶氮唑鹽，使之還原為藍(lán)黑色的甲，其形成量與細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞功能狀態(tài)呈正相關(guān)。通過(guò)酶聯(lián)儀在一定波長(zhǎng)段比色分析，即可反映細(xì)胞增殖情況。該方法的特點(diǎn)是既簡(jiǎn)便快速，又準(zhǔn)確敏感，不接觸同位素，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果又與同位素?fù)饺敕ㄓ辛己孟嚓P(guān)性。所以，MTT檢測(cè)方法一經(jīng)創(chuàng)立，便迅速得到科研工作者的認(rèn)可與推廣。目前，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室采用MTT檢測(cè)法，多為臨時(shí)自配MTT染液及反應(yīng)終止液。由此帶來(lái)明顯的缺陷：一、造成物力人力浪費(fèi)。自配的MTT染液，有效期一般僅為2周，這對(duì)眾多科研及檢測(cè)單位來(lái)說(shuō)，難以做到物盡其用，每次實(shí)驗(yàn)不得不重新配制；二、造成實(shí)驗(yàn)誤差。MTT檢測(cè)法的關(guān)鍵在于MTT反應(yīng)終止液的配制。現(xiàn)有技術(shù)配制的MTT反應(yīng)終止液的缺陷主要表現(xiàn)在藍(lán)黑色甲結(jié)晶溶解不徹底，蛋白質(zhì)絮狀沉淀較多，所獲OD值偏低。另外，終止反應(yīng)呈色不穩(wěn)定，其OD值在數(shù)小時(shí)內(nèi)就會(huì)逐漸下降，不利于重復(fù)測(cè)定。

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種MTT染液及其配制方法，能夠提高其有效使用期，避免人力物力的浪費(fèi)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種MTT法反應(yīng)終止液及其配制方法，提高反應(yīng)終止液的溶解效果以及呈色反應(yīng)的穩(wěn)定性和可靠性。

本發(fā)明的目的由以下措施來(lái)實(shí)現(xiàn)：

MTT染液及其配制方法；將MTT溶解于磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖生理鹽水中，MTT含量為2～8mgMTT/ml緩沖生理鹽水加溫至37℃，并振蕩，用微孔濾膜過(guò)濾除菌，避光保存在-20℃以下。

反應(yīng)終止液及其配制方法；反應(yīng)終止液由十二烷基硫酸鈉、二甲基甲酰胺、雙蒸水組成，其重量比為0.34～0.46∶0.7～1.3∶1。將上述三種組分混合均勻，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH為4.3～5.3，加溫至37℃，并反復(fù)振蕩，使十二烷基硫酸鈉完全溶解，離心，除去雜質(zhì)，常溫下保存。

實(shí)施例

1、MTT染液的配制：

(1)配制0.01M磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖生理鹽水，pH7.4；

(2)按5mgMTT/ml上述緩沖生理鹽水配制MTT溶液；

(3)加溫至37℃，并振蕩，使MTT完全溶解；

(4)用0.22μm濾膜雙層過(guò)濾除菌，于-20℃以下避光保存。

2、反應(yīng)終止液的配制：

(1)按十二烷基硫酸鈉∶二甲基甲酰胺∶雙蒸水(重量比)＝0.4∶1∶1混合均勻；

(2)用冰乙酸調(diào)節(jié)上述溶液的pH為4.8；

(3)加溫至37℃，并反復(fù)振蕩，使十二烷基硫酸鈉完全溶解；

(4)以3000rn離心，除去雜質(zhì)，于常溫下保存。

為證明本發(fā)明所述的MTT染液和反應(yīng)終止液的使用效果，做以下對(duì)比試驗(yàn)一、材料

1、貼壁生長(zhǎng)的Smiss?3T3細(xì)胞株，中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所提供。

2、不同貯存期的現(xiàn)有技術(shù)試劑和本發(fā)明試劑。

3、3H-TdR，中國(guó)原子能科學(xué)研究院產(chǎn)品，訂購(gòu)后一年內(nèi)使用。

4、儀器：西德Heraeus公司B5060型二氧化碳培養(yǎng)箱。國(guó)產(chǎn)DG-3022型酶聯(lián)儀。二、方法

1、傳代培養(yǎng)生長(zhǎng)良好的L929細(xì)胞，0.25％Trypsin-0.02％EDTA消化、洗滌二次，計(jì)數(shù)，再以10％MBS的DMEN培液將細(xì)胞稀釋成不同濃度，加入96孔平底培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司產(chǎn)品)，100μl/孔，同一稀釋度設(shè)三個(gè)復(fù)孔。

2、將細(xì)胞置37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)，見(jiàn)細(xì)胞貼壁，形態(tài)良好。加入MTT染液15μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后加入反應(yīng)終止液，100μl/。孔微型振蕩器上振蕩10分鐘，密封后置37℃飽和濕環(huán)境下待測(cè)。

3、酶聯(lián)儀測(cè)定OD值，檢測(cè)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm，并在終止液加入后12、24、36及72小時(shí)多次監(jiān)測(cè)，觀察其OD值穩(wěn)定性。三、結(jié)果

見(jiàn)圖一。從圖一可見(jiàn)，本發(fā)明試劑貯放8個(gè)月后使用仍然有效可靠，質(zhì)量不變，且比同類試劑敏感準(zhǔn)確。而現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的同類試劑置放8個(gè)月后質(zhì)量明顯下降，不能反映實(shí)際的細(xì)胞數(shù)量。