[發(fā)明專利]采用湍流冷卻氣流控制凝膠電泳期間的溫度梯度

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 95193409.0
• 申請日: 1995-04-03
• 公開（公告）號: CN1150476A
• 公開（公告）日: 1997-05-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 道格拉斯·H·史密斯;布賴恩·J·米夫薩德;迪安·S·伯吉;托馬斯·E·戴維斯;史蒂文·M·馮哈伊斯蒂
• 申請（專利權(quán)）人: 杰諾米克斯公司
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 柳沈知識(shí)產(chǎn)權(quán)律師事務(wù)所
• 代理人: 巫肖南

本發(fā)明涉及進(jìn)行DNA測序時(shí)，采用板式凝膠電泳對單鏈DNA片段的分離。具體說來，本發(fā)明涉及借助板式凝膠電泳進(jìn)行DNA順序分析的裝置，該裝置包括一種以湍流氣體熱交換介質(zhì)沖擊為基礎(chǔ)的溫度控制部件。本發(fā)明突擊特點(diǎn)是，電泳期間凝膠分離介質(zhì)中產(chǎn)生的熱溫度梯度降至最小。因此，使用本發(fā)明裝置，將改善DNA順序分析的速度，可靠性及清晰度。

凝膠電泳是一項(xiàng)基本生化分離技術(shù)，它成為根據(jù)分子大小、電荷或二者結(jié)合，來區(qū)分各種生物學(xué)重要分子之基礎(chǔ)。采用凝膠電泳能很好分離的生物分子的具體例包括蛋白質(zhì)和核酸。電泳通常在含有電導(dǎo)緩沖液的膠狀物(如瓊脂糖)或高聚物(如聚丙烯酰胺)介質(zhì)(一般稱為“凝膠”)中進(jìn)行。借助穿過凝膠截面的化學(xué)惰性金屬電極施加電壓，方進(jìn)行電泳。所要研究的生物樣品，置于該凝膠中預(yù)先形成的樣品井中(sample?well)，該井通常位于凝膠一端，所施加電壓的極性要使得該生物樣品通過凝膠朝電極之一泳動(dòng)(遷移)(通常指位于與樣品相對的凝膠一端之電極)。假如適宜，可通過加入化學(xué)改性劑(如脲、甲酰胺、或十二烷基硫酸鈉)至凝膠，以及電泳緩沖液，來維持泳動(dòng)距離和分子大小之間的反線性關(guān)系。

凝膠電泳的特殊應(yīng)用，是測定所研究核酸的核苷酸順序時(shí)，分離單鏈DNA片段。為此目的，要匯集經(jīng)核酸化學(xué)降解產(chǎn)生(使用Gilbert法，例如見Maxam和Gilbea(1980)，Methods?Enzyme，65，P499-500)，或使用聚合酶進(jìn)行替換DNA合成產(chǎn)生(采用Sanger法，例如見Sanger，F(xiàn).，Niklen，S.，和Coulson，A.R.(1977)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA74，P5463-5467)的單鏈DNA片段。所匯集的單鏈DNA片段，包括與欲測定順序中各位置相對應(yīng)的片段，在最頻繁使用的測序法中，此種對應(yīng)直接關(guān)系到退火的引物中聚合反應(yīng)引發(fā)固定位點(diǎn)至欲測序核酸之距離。因而，所需順序的測定取決于各片段的分離，這些片段的長度差別只有一個(gè)核苷酸。

對各位置各自可能的核苷酸的鑒別(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸苷)，傳統(tǒng)方法是，在單獨(dú)的化學(xué)反應(yīng)混合物中，進(jìn)行對各末端核甘酸具特異性的測序反應(yīng)來加以區(qū)分。這樣，一般在4個(gè)分開的試管中進(jìn)行各個(gè)測序?qū)嶒?yàn)，在這些試管中，形成各末端處于與該反應(yīng)所利用的末端核苷酸相對應(yīng)位置處的各種片段之匯集。然后，將一組4種反應(yīng)物各自進(jìn)行改性(dena?turing)凝膠電泳測定核苷酸順序，每種反應(yīng)物在單一測序凝膠的相鄰泳道中獨(dú)自電泳。該凝膠的某核苷酸特異泳道中某位置上存在的譜帶，便表明鑒定出所測順序中，該位置上有此種核苷酸。使用常規(guī)技術(shù)，將各片段進(jìn)行放射性標(biāo)記，電泳之后，借助放射自顯影法可使這些譜帶顯現(xiàn)出來。

此外，最近的技術(shù)改進(jìn)開發(fā)出自動(dòng)測序機(jī)。此種機(jī)器在與載樣井相對的凝膠末端裝有分光光度檢測裝置。使用熒光標(biāo)記引物，或熒光標(biāo)記核苷酸合成DNA片段。在每種情況下，各核苷酸反應(yīng)分別連續(xù)進(jìn)行，其中用有區(qū)別的熒光標(biāo)記物來對相應(yīng)于各核苷酸的片段進(jìn)行熒光標(biāo)記。然而，因?yàn)槊糠N熒光標(biāo)記物表現(xiàn)出特性頻率的熒光發(fā)射作用，因此可從其熒光發(fā)射信號來區(qū)分各片段末端位置所要鑒定的核苷酸。該特征使得可以用該裝置借助分光光度法自動(dòng)化匯集核苷酸順序資料。另外，各片段存在不同熒光信號，也使得四種分開的定順反應(yīng)產(chǎn)物可在凝膠的單一泳道進(jìn)行電泳。

這些技術(shù)的開發(fā)，提高了對核苷酸測序反應(yīng)中產(chǎn)生的測序片段精確和可靠分離之要求。然而，就該技術(shù)領(lǐng)域現(xiàn)狀來說，現(xiàn)有板式凝膠電泳技術(shù)存在許多尚未解決的固有技術(shù)局限性。例如，由于對區(qū)分分離片段范圍的局限性，迫使各測序反應(yīng)物系列加樣于凝膠上時(shí)要分兩次加于兩組泳道中。第一次加樣的泳道(由此電泳最長)用于測定距聚合反應(yīng)引發(fā)位最遠(yuǎn)的核苷酸順序(因而是最長的片段)，而第二次加樣的一組被理解為測定最靠近引發(fā)位的核苷酸順序。加樣的相對時(shí)間安排和允許反應(yīng)物的電泳時(shí)間靠經(jīng)驗(yàn)選擇，以使這些范圍相符(overlap)，這樣，便可以看到任何特定核苷酸順序的一個(gè)完整部份。該電泳的這些局限性的結(jié)果是，可從給定位點(diǎn)引發(fā)的測序反應(yīng)，看到最多350-400堿基。因此，若開發(fā)能分辨比目前可能的長度較長之核苷酸順序的方法和裝置，將是對該領(lǐng)域有益的促進(jìn)。

對使用常規(guī)電泳技術(shù)能獲得核苷酸順序資料之程度的許多其它技術(shù)局限性，在于使用板式凝膠電泳分析DNA順序所需電泳條件造成的。其中最為顯著仍是電泳期間凝膠中所產(chǎn)生的熱溫度梯度。