[發明專利]體外再生丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白酶的解蛋白活性的方法

無效

• 申請號: 95191747.1
• 申請日: 1995-02-14
• 公開（公告）號: CN1141591A
• 公開（公告）日: 1997-01-29
• 發明（設計）人: R·狄弗朗希斯克;C·法拉;L·托梅
• 申請（專利權）人: 布·安格萊荻公司分子生物學研究所
• 主分類號: A61K38/43
• 分類號: A61K38/43;A61K38/48;G01N33/48;C12Q1/37
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所
• 代理人: 李瑛

????????????????????描述

本發明的主題是再生與HCVNS3蛋白質相關的絲氨酸蛋白酶活性的方法，其利用了HCV蛋白質NS4A或其中所含的序列作為絲氨酸蛋白酶活性或普遍而言與NS3相關的酶活性的輔助因子的能力。

人們知道，丙型肝炎病毒(HCV)是非A、非B型肝炎(NANB)的主要病原。據估計，HCV引起至少90％的輸血后NANB病毒性肝炎和50％的散發性NANB肝炎。雖然在選擇血液供體和輸血所用血液的免疫學特征鑒定方面取得了重大進展，但在接受輸血的人中急性HCV感染的水平仍較高(全世界每年一百萬例或更多)。大約有50％HCV感染患者在長達5-40年的期限內會發展為肝硬化。另外，最近的臨床研究表明，慢性HCV感染與肝細胞癌變之間具有一定的關系。

HCV是一種含有約9.4kb的RNA陽性基因組的具被膜病毒。這種病毒是黃病毒科的一個成員，該科的其它成員為黃病毒和病蟲害病毒。近年來人們繪制出了HCV的RNA基因組圖譜。對從世界多處地方分離出的HCV基因組序列的比較表明，這些序列可以是極為異源性的。HCV基因組的大部分為開放式解讀密碼(ORF)，其為9030至9099個核苷酸不等。這個ORF可為一單個病毒多蛋白編碼，其長度為3010-3033個氨基酸不等。在病毒感染周期中，多蛋白被解蛋白性地加工為病毒復制所必需的單個基因產物。編碼HCV結構蛋白的基因位于ORF的5’末端，而非結構蛋白的編碼區則占據ORF的其余部分。

結構蛋白由C(核心，21kDa)、E1(被膜，gp37)和E2(NS1，gp61)組成。C為-21kDa的非糖基化蛋白，其可能構成病毒的核蛋白殼。蛋白E1為一約37kDa的糖蛋白，據信其為病毒外被膜的結構蛋白。E2是另一61kDa的膜糖蛋白，其可能是病毒外被膜的第二種結構蛋白。

非結構區始于NS2(p24)，這是一種功能尚不清楚的24kDa的疏水蛋白質。NS3是一種68kDa的蛋白質，其在多蛋白中跟隨著NS2，預計有兩個功能區：前200個氨基末端氨基酸中的絲氨酸蛋白酶區，和羧基末端處的RNA依賴性ATP酶區。與NS4相對應的基因區分別編碼NS4A(P6)和NS4B(P26)——兩種6和26kDa的疏水蛋白質，它們的功能尚未弄清。與NS5相對應的基因分別編碼56和65kDa的NS5A(P56)和NS5B(P65)兩種蛋白質。存在于所有RNA依賴性RNA聚合酶中的氨基酸序列可在NS5區中得到識別。這就意味著NS5區含有病毒復制工具的部分。

多項分子生物學研究表明，信號肽酶(與宿主細胞內質網相關的一種蛋白酶)關系到非結構區中的解蛋白加工，這就是說位于C/E1、E1/E2和E2/NS2位點處。NS3中含有的絲氨酸蛋白酶關系到NS3與NS4A之間、NS4A與NS4B之間、NS4B與NS5A之間和NS5A與NS5B之間接合點處的切割。特別是，已經發現，由這種絲氨酸蛋白酶進行的切割在開裂鍵的氨基末端側(P1位)留下了半胱氨酸或蘇氨酸的殘基，而在其羧基末端側(P1’位)留下了丙氨酸或絲氨酸殘基。HCV的第二種蛋白酶活性似乎關系到NS2與NS3之間的切割。這種蛋白酶活性存在于由含有絲氨酸蛋白酶區的NS2部分和NS3部分所組成的區域中，但并不使用同樣的催化機制。

按照以上描述，可以認為NS3蛋白酶是用于開發抗HCV治療劑的一種潛在性目標。然而，對這類治療劑的探索一直受到阻礙，這是因為體外NS3所表現的絲氨酸蛋白酶活性太低以致無法對抑制劑進行篩選。

人們意外地發現，可通過采用本發明的方法來克服這種至關重大的局限性。本方法還具有下述一些優點。

依據本發明，可通過在反應混合物中利用NS3和NS4A中所含的序列是體外再生HCV蛋白酶NS3的解蛋白活性方法的特征。

當NS4A與NS3的比例為1∶1時，可獲得絲氨酸蛋白酶的最佳活性。

NS3和NS4A還可以作為NS3-NS4A前體摻入反應混合物中，因為通過自蛋白水解反應，這個前體將產生等摩爾量的NS3和NS4A。

在前體中使NS3與NS4A之間的切割位點發生突變也是可能的，這樣NS4A仍會同NS3共價相連。不影響NS3解蛋白活性的序列隨后可從這個非解蛋白前體中除去。

本發明還涉及一種新的組合物，其特征在于它包含序列如SEQID?NO：1和SEQ?ID?NO：2所示的蛋白質或其中所含的或自其中衍生的序列。可以理解，因為所有的RNA病毒都表現高度的變異性，所以這些序列在不同的HCV分離物中可有所變化。這種新的組合物具有獲得數種非結構HCV蛋白質的蛋白水解突變所必需的蛋白水解活性。