[發明專利]通過隨機片段化和重裝配進行的DNA誘變

無效

• 申請號: 95191679.3
• 申請日: 1995-02-17
• 公開（公告）號: CN1145641A
• 公開（公告）日: 1997-03-19
• 發明（設計）人: 威利姆·P·C·斯泰莫;安德利亞斯·克拉默瑞
• 申請（專利權）人: 阿菲馬克斯技術公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司
• 代理人: 王達佐

1.用于將一個或多個突變導入模板雙鏈多核苷酸的方法，其中模板雙鏈多核苷酸已裂解成所需大小的雙鏈隨機片段，該方法包括：

a)將一種或多種單鏈或雙鏈寡核苷酸加入所得的雙鏈片段群體中，其中所說的寡核苷酸包含與模板多核苷酸相同的區域和異源區域；

b)將所得的雙鏈隨機片段與寡核苷酸的混合物變性成單鏈片段；

c)在導致所說單鏈片段在單鏈片段之間相同區域上退火的條件下將所得的單鏈片段群體與聚合酶保溫并形成誘變的雙鏈多核苷酸；以及

d)重復步驟(b)和(c)。

2.權利要求1的方法，其中在雙鏈片段混合物中特定雙鏈片段的濃度不超過總DNA重量的1％。

3.權利要求1的方法，其中不同特定雙鏈片段的數目包括至少大約100個。

4.權利要求1的方法，其中雙鏈片段的大小從56bp到5kb。

5.權利要求1的方法，其中誘變的雙鏈多核苷酸的大小包含50bp到100kb。

6.生產具有生物活性重組蛋白質的方法，包括：

a)在提供將所說模板多核苷酸裂解成具有所需大小的隨機雙鏈片段的條件下處理包含編碼野生型蛋白質的雙鏈模板多核苷酸的樣品；

b)向所得的隨機片段的群體中加入一種或多種單鏈或雙鏈寡核苷酸，其中所說的寡核苷酸包含模板多核苷酸的相同區和異源區；

c)將所得的雙鏈隨機片段和寡核苷酸的混合物變性成單鏈片段；

d)在導致所說的單鏈片段在相同區域退火的條件下將所得的單鏈片段群體與聚合酶保溫并形成誘變的雙鏈多核苷酸；

e)重復步驟(c)和(d)；

f)從誘變的雙鏈多核苷酸表達重組蛋白質。

7.權利要求6的方法，其中在步驟(a)中雙鏈片段混合物中的特定雙鏈片段的濃度不到總DNA重量的1％。

8.權利要求6的方法，其中步驟(a)中不同的特定雙鏈片段的數目包含至少大約100個。

9.權利要求6的方法，其中雙鏈片段的大小是從大約5bp到5kb。

10.權利要求6的方法，其中誘變的雙鏈多核苷酸大小包括從50bp到100kb。

11.權利要求6的方法，進一步包含從重組蛋白質群體中選擇所需的重組蛋白質。

12.獲得嵌合多核苷酸的方法，包含：

a)在提供將所說的模板多核苷酸裂解成所需大小的隨機雙鏈片段的條件下處理包含不同雙鏈模板多核苷酸的樣品，其中所說的不同模板多核苷酸含有相同區和異源區；

b)將包含在步驟(a)產生的處理樣品中的所得隨機雙鏈模板片段變性成單鏈片段；

c)在提供靶單鏈片段在相同區域退火的條件下將所得的單鏈片段與聚合酶保溫并形成包含模板多核苷酸序列的嵌合雙鏈多核苷酸序列；

d)按需要重復步驟(b)和(c)。

13.權利要求12的方法，其中在步驟(a)中雙鏈片段混合物中的特定雙鏈片段濃度不超過總DNA重量的1％。

14.權利要求12的方法，其中步驟(a)不同的特定雙鏈片段的數目包含至少大約100個。

15.權利要求12的方法，其中雙鏈片段的大小是從大約5bp到5kb。

16.權利要求12的方法，其中誘變的雙鏈多核苷酸的大小包含從50bp到100kb。

17.復制模板多核苷酸的方法，該方法包括：體外結合單鏈模板多核苷酸與來自模板多核苷酸裂解和變性的小隨機單鏈片段，在形成雙鏈模板多核苷酸群體的條件下，在核酸聚合酶存在的條件下保溫所說的核酸片段混合物。