[發明專利]一種固定化活細胞的制備方法

無效

• 申請號: 94115087.9
• 申請日: 1994-08-26
• 公開（公告）號: CN1049685C
• 公開（公告）日: 2000-02-23
• 發明（設計）人: 邱懷廣;施柔遠
• 申請（專利權）人: 北京市食品釀造研究所;北京市釀造六廠
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;C12N11/04
• 代理公司: 北京市專利事務所
• 代理人: 郭佩蘭

本發明涉及一種固定化活細胞的制備方法，特別是采用聚乙烯醇作載體的固定化方法。

固定化活細胞技術是近幾年來繼固相酶技術后迅速發展起來的生物工程新技術，該技術采用包埋法將肉眼看不清的微生物活細胞固定在載體上，形成直觀的固定化活細胞實體，活細胞仍能增殖，新陳代謝，其酶系完整，可迅速完成一系列復雜的生化反應，得到有用產物。

在固定化方法中，載體可以是天然或合成高分子材料，例如，褐藻膠，K-卡拉膠，聚丙烯酰胺等，其中，褐藻膠，K-卡拉膠存在強度差、使用壽命短等缺點(只有1000多個小時)，而聚丙烯酰胺由于其單體分子及聚合促進劑等皆具毒性，不利于微生物活細胞的生長，在高分子材料中，采用聚乙烯醇(PVA)材料，不具毒性甚至對人體亦公認無害，價格低，較適合于包埋微生物活細胞，已有以PVA為載體的固定化方法，尚存在一些缺點，例如：將微生物或酶與PVA溶液混合后，置于飽和硼酸溶液中短時間內使其形成球體，隨之將球體與磷酸鹽溶液接觸，使其完全硬化，制成微生物或酶固定化產物，這種方法存在步驟多，無機鹽濃度高，對微生物生長不利等缺點；有些采用PVA載體的固定化方法中，需要有具空干燥脫水步驟，工藝復雜，費時；有的需用模具成形，或加油類作為成形劑，其效果均不太理想。

本發明的目的是提供一種固定化活細胞的制備方法，該方法簡便，不需在模具中成形，機械強度高，適合于工業化生產，并能長期反復使用。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：制備方法中采用PVA為載體，首先將聚乙烯醇溶液與活細胞懸浮液混合，以無菌淀粉為隔離成形劑成型，再經低溫冷凍定型，室溫自然解凍、漂洗后用鉸碎機鉸碎成顆粒狀產物。

在固定化活細胞混合液中，聚乙烯醇濃度控制在10-20％(W/W)，活細胞懸浮液濃度在2-20％(W/W)，其余為水；無菌淀粉與混合液的重量比為0.5-2∶1；冷凍溫度在-10-30℃，時間48小時-12小時，解凍溫度一般控制在5-40℃，最好是10-25℃的室內，自然空氣中解凍5-48小時。聚乙烯醇的聚合度在400-1900之間，最好控制在1750±75，聚乙烯醇濃度最好為15±0.5％(W/W)，PVA聚合度過高，流動性差，操作不便，過低不易成型。

無菌淀粉制備：普通淀粉100℃，干熱滅菌1小時，或常壓干蒸15分鐘(上汽計時)，務使其中心溫度達100℃，然后冷卻至20-30℃，即為無菌淀粉。

制得固定化微生物活細胞可直接用于生產，邊增殖邊發酵，也可先在適宜的培養基中培養增殖一段時間后再用于生產。

以下結合實施例對本發明作進一步說明：

實施例1：

制備固定化啤酒酵母活細胞6Kg，各組分配比：啤酒酵母懸浮液(活細胞數10⁶-10⁹個/ml)0.6Kg，聚乙烯醇0.9kg，水4.5kg，淀粉5kg，其操作步驟是：將PVA放入水中，攪勻，用沸水浴或蒸汽浴加熱溶解，溫度在80-120℃，溶解后冷卻至室溫，加無菌水補足溶解時損失的水量，隨后加入啤酒酵母懸浮液，混合均勻，將上述粘液進行成形處理，即以一直徑為5-25mm的噴嘴，以均勻速度注入予置滅菌淀粉的容器中，形成線條層狀，條間、層間以無菌淀粉隔離成型，再經冷凍處理定型，溫度為-30℃，時間12小時，將冷凍產物進行自然解凍，溫度為20℃，時間36小時，(全部軟化為止)，除去大部分淀粉后，漂洗2-5次，至水清亮為止。產物以Φ8mm的無菌絞肉機絞碎處理，得到直徑為2-5mm的顆粒狀產物。

上述所使用的淀粉可回收重復使用。將制得的固定化酵母活細胞取出4.3kg，放入容積12.5升的酒化生物反應器中，從下部泵入16％(折光計)糖化液，上部流出8％(折光計)的酒化液，流速0.1L/h，溫度10-30℃，

酒化液：乙醇7.3％(V/V)，總酸0.15％(W/V，以HAC計)還原糖1.1％(W/V，以葡萄糖計)。

連續發酵4800小時，載體強度無任何降低。可使用1年甚至數年。

實施例2：

制備固定化醋酸菌活細胞6kg，其各組分的配比，聚乙烯醇0.9kg、水4.5kg、淀粉5kg、醋酸菌體懸浮液(活細胞數10⁸個/ml)0.6kg，其操作步驟同實施例1。