[發(fā)明專利]生產(chǎn)色氨酸的微生物及其制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 93117586.0
• 申請日: 1993-09-21
• 公開（公告）號: CN1065909C
• 公開（公告）日: 2001-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 岡特·維歇;沃爾弗來德·萊因菲爾德;基思·巴克曼
• 申請（專利權(quán)）人: 電化學工業(yè)有限公司(國際)
• 主分類號: C12N1/00
• 分類號: C12N1/00;C12N1/21;C12N15/31;C12P13/22;//;C12R119;C12R115)
• 代理公司: 永新專利商標代理有限公司
• 代理人: 林曉紅

本發(fā)明涉及生產(chǎn)色氨酸的微生物及其制備方法。

大家知道色氨酸代謝在目前所研究過的所有微生物中只以一個單一生物合成途徑進行(Somerville，R．L．，Herrmann，K．M．，1983，氨基酸，生物合成和基因調(diào)控(Aminoacids，Biosynthesisand?Genetic?Regulation)，Addison-Wesley?Publishing?Company，USA：30l-322和351-378；Aida?et?al．，1986，氨基酸生產(chǎn)的生物學方法，工業(yè)微生物學進展(Biotechnology?of?aminoacidproduction，progress?in?industrial?microbiology)Vol?24，ElsevierSciencepublishers，Amsterdam：188-206)。色氨酸代謝途徑以及與絲氨酸代謝的聯(lián)系和編碼主要酶的基因列在圖1中。

已知的色氨酸生產(chǎn)方法是基于一個突變的trpE基因的表達，該基因編碼有色氨酸不敏感的鄰氨基苯甲酸(anthranilate)合酶，以及基于在合適的可自動復(fù)制的載體上的trp操縱子的其他基因的表達。由于這些基因的相對高拷貝數(shù)，trp基因的表達也多，對應(yīng)的色氨酸代謝中的每一種酶的量也增加了。這導致色氨酸的過量生產(chǎn)。

下面舉一些這種生產(chǎn)色氨酸方法的例子，有許多微生物用于這個過程，如大腸桿菌：EP0293207，US4，371，614，芽孢桿菌：US4，588，687，棒狀桿菌(Corynebacterium)和短桿菌(Brevibacterium)：EP0338474。在這個生產(chǎn)過程中，會存在不穩(wěn)定性、載體丟失或生產(chǎn)菌株生長速度慢等問題。

EP-A-O401735(申請人：Kyowa?Hakko?Kogyo?Co．)描述了以含有重組質(zhì)粒的棒狀桿菌或短桿菌來生產(chǎn)L-色氨酸的方法。在這些質(zhì)粒中含有合成DAHP合酶，鄰氨基苯甲酸合酶，吲哚-3-甘油-P合酶，色氨酸合酶和磷酸甘油脫氫酶的遺傳信息。使用了抗反饋鄰氨基苯甲酸合酶的等位基因。

進而我們也知道可通過給生產(chǎn)菌株引入許多serA，或serA，B，C野生型基因?qū)е律彼岽x去調(diào)控來增加色氨酸的生產(chǎn)。因此化學文摘CA111(1989)168688q和CA111(1989)168689r描述了分別引入在質(zhì)粒上的serA野生型等位基因和絲氨酸代謝的全部野生型基因(serA，serB和serC)的芽孢桿菌菌株能過剩表達它們來生產(chǎn)色氨酸。

在EP-0149539(申請人：Stauffer?Chemical?Company)中揭示了通過在細胞中防止絲氨酸降解來提高色氨酸產(chǎn)量的方法。在這個專利申請中使用了破壞絲氨酸降解酶(絲氨酸脫氨酶，Serinedeaminase，sda)的大腸桿菌K12突變體，同時還描述了用這類菌株來生產(chǎn)氨基酸。例Ⅷ中描述一個這種類型的菌株，從鄰氨基苯甲酸中大量生產(chǎn)色氨酸的方法。和歐洲專利申請所提到的一種具有完整絲氨酸脫氨酶的菌株生產(chǎn)色氨酸相比，色氨酸產(chǎn)量提高的解釋是氨基酸前體儲量非常高的微生物中絲氨酸或絲氨酸生物合成能力限速色氨酸的生產(chǎn)。

本發(fā)明的目的是提供能增加色氨酸產(chǎn)量的微生物和提供使這種微生物制備成為可能的一些方法。

本發(fā)明的目的可以通過微生物菌株來實現(xiàn)。這些菌株的特征在于具有一個去調(diào)控的(deregulated)色氨酸代謝和一個至少由一個抗反饋serA等位基因而去調(diào)控的絲氨酸代謝。

本發(fā)明中，抗反饋serA等位基因位點意味著serA基因的突變體，它編碼一個對絲氨酸具有敏感性的磷酸甘油脫氫酶，但該酶的絲氨酸敏感性要低于這個菌株相應(yīng)的野生型磷酸甘油脫氫酶的絲氨酸敏感性。

至少一個抗反饋serA等位基因與去調(diào)控的色氨酸代謝的微生物的按本發(fā)明結(jié)合會導致色氨酸產(chǎn)量的增加。令人驚奇的是和不具有抗反饋serA等位基因的相同微生物在相同的培養(yǎng)條件下產(chǎn)量經(jīng)比較，前者較后者高出2．6倍。