[發(fā)明專利]一種核甙酸引物的設(shè)計(jì)與應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 93115112.0
• 申請(qǐng)日: 1993-11-20
• 公開（公告）號(hào): CN1103110A
• 公開（公告）日: 1995-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李運(yùn)有
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12P19/34
• 分類號(hào): C12P19/34;C12Q1/68;C12Q1/25
• 代理公司: 江蘇省專利事務(wù)所
• 代理人: 牛莉莉,虞希光

本發(fā)明涉及一種核甙酸引物的設(shè)計(jì)與應(yīng)用，特別是一種應(yīng)用于聚合酶鏈反應(yīng)的核甙酸引物的設(shè)計(jì)與應(yīng)用。

目前，核甙酸引物用于人體心肌疾病肌球蛋白DNA突變的研究，已有報(bào)導(dǎo)，如Friedman?E，GordeladzeJO，Geiman?JJ，et?al.Hypertrohic?cardiomyopathy：fai-lure?to?demonstrate?mutations?in?exon?13?ofthe?cardiac?beta-myosin?heavy?chain?gene.BasicRes?Cardiol?1992;87：106112.?Friedman設(shè)計(jì)的M1引物（核甙酸序列為5′?CTT?ACC?AAC?TTT?GCT?CTT?GCC）與3′Ⅰ引物（核甙酸序列為5′?AAC?TCT?CAT?CCC?ACC?ATG?CC）配合使用，僅可對(duì)肌球蛋白重鏈基因第8746至第8951位的205bp?DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，即只能擴(kuò)增一個(gè)突變點(diǎn)區(qū)域，分析效率低。而位于第13和第14外顯子的肌球蛋白基因第8848位和第9124位最易發(fā)生突變，導(dǎo)致心臟病，對(duì)這第二個(gè)突變點(diǎn)區(qū)域尚需設(shè)計(jì)新的引物進(jìn)行擴(kuò)增，否則就無法研究該區(qū)段內(nèi)存在的基因突變。

本發(fā)明的目的是，設(shè)計(jì)一種能與M1引物配合使用，擴(kuò)增肌球蛋白兩個(gè)最常見突變點(diǎn)區(qū)域DNA片段的核甙酸引物，研究該區(qū)域內(nèi)存在的基因突變。

本發(fā)明的技術(shù)方案是，根據(jù)肌球蛋白重鏈基因序列及引物設(shè)計(jì)的基本規(guī)則，利用電腦分析該引物的特異性，預(yù)測(cè)其擴(kuò)增效果，設(shè)計(jì)出M3寡聚核甙酸引物，其核甙酸序列為5′?TGA?CTG?CCT?CTG?TCA?CCA?CA3′，并用人工將其合成，經(jīng)過測(cè)定濃度，應(yīng)用于聚合酶鏈反應(yīng)。

本發(fā)明M3引物與M1引物合用，可以擴(kuò)增肌球蛋白重鏈基因第8746至第9303位的DNA片段，該區(qū)域內(nèi)包括第13（8848位）和第14（9124位）外顯子，前者易由G突變?yōu)锳，該突變可由DdeI酶切識(shí)別，突變后在該位置多一個(gè)DdeI切點(diǎn)，后者易由C突變?yōu)門，可由NIa3識(shí)別，突變后在該位置多一個(gè)NIa3切點(diǎn)。電泳后可直接看到突變結(jié)果。同時(shí)該擴(kuò)增片段存在的各種突變均可由單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法檢出。本發(fā)明M3引物與M1引物合用，擴(kuò)增效率很高，特異性強(qiáng)，只擴(kuò)增出一條帶，包括兩個(gè)常見的易發(fā)突變位點(diǎn)，因此用同一次擴(kuò)增結(jié)果，可以同時(shí)分析兩個(gè)突變位點(diǎn)是否存在，分析效率提高一倍。

本發(fā)明M3引物應(yīng)用實(shí)施例：根據(jù)所測(cè)的M3引物濃度，用TE0.1（10mmol/L?Tris，0.1mmol/L?EDTA，pH8.0）把引物稀釋為50pmol/μl，加0.5-0.1μl至以下反應(yīng)體系中，同時(shí)加入等量M1：

dH20??37μl

10xPCR緩沖液??5μl

dATP?dCTP?dGTP?dTTP??各2μmol/L

人外周血或心肌DNA模板??100mg

高純度石蠟油??30μ

在基因擴(kuò)增儀上95℃變性5分鐘后，加入TaqDNA聚合酶2單位后，94℃變性40S，62℃退火30S，72℃延伸90S，共運(yùn)行45個(gè)循環(huán)，其中后20循環(huán)的72℃延伸90S后，每循環(huán)自動(dòng)增加4秒。運(yùn)行完畢后取20μl進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，同時(shí)還可取10μl加等體積95%甲酰胺溴酚藍(lán)進(jìn)行SSCP，銀染色觀察結(jié)果。

M1M3擴(kuò)增片段為557bp，如果在第8848位存在點(diǎn)突變，用Ddel酶切后會(huì)產(chǎn)生小于正常的片段，分別為394，68，63，32bp。與突變前片段（426，68，63bp）在電泳上顯著不同;如果在第9124位存在點(diǎn)突變，用Nla3酶切也產(chǎn)生小于正常的片段，分別為175，145，141，56，40與突變前片段不同。不用酶切時(shí)可用SSCP篩檢可能存在的所有突變。