[發明專利]制備干擾素α-2晶體的方法

無效

• 申請號: 91103687.3
• 申請日: 1991-06-04
• 公開（公告）號: CN1033035C
• 公開（公告）日: 1996-10-16
• 發明（設計）人: 保羅·賴歇特;杰拉爾德·S·哈蒙德;洪·V·李;塔坦納哈里·L·納加布胡山;保羅·P·特羅塔
• 申請（專利權）人: 先靈公司
• 主分類號: C07K14/56
• 分類號: C07K14/56;A61K38/21
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 姜建成,曹恒興

人干擾素α是一類至少包含24個亞種的蛋白(Zoon?K.C.，Interferon?9：1-12，1987，Gresser?I.編.Academic?Press，New?York)。它們原來被描述為能夠在細胞內誘導抗病毒狀態的藥劑，但現在被稱為影響免疫系統許多功能的多效性淋巴激活素(Opdenakker等，Experimentia45：513-520，1989)。除了其體外生物活性外，人干擾素α目前用于幾種重要的指征，例如毛細胞性白血病、卡波濟肉瘤、尖銳濕疣等，并正在研究將其用于其他幾種指征(Intron?A(干擾素α-2b)Cliniea?1?Status(1989))。這是從1989年9月在英國倫敦召開的第五屆歐洲臨床腫瘤學大會的一個附屬討論會上得來的進展。對結構的闡明及各種劑型的配制來說，最為重要的是要得到高度純化的結晶態干擾素α，尤其是重組型α-2b。

現已報道了兩種形式的結晶人干擾素α-2(Miller等，Science?215：689-690，1982；Kung等，美國專利4,672,108；Weissmann，“干擾素的克隆及其它錯誤”，Interferon?1981，Ion?Gresser編，Acadmic?Press，New?York，101-134；Weissmann，Phil.Trans.R.Soc.Lond.，B299：7-28，1982；Nagabhusban等，“遺傳工程α-2干擾素的定性鑒定”，Interferon：Research，Clinical?Application?andRegulatory?Consideration，Zoon等編，Elsevier，New?York?79-88，1982)。這些出版物敘述了在低溫下從聚乙二醇中結晶干擾素α-2的方法，或者通過調節pH或溫度而從磷酸鹽緩沖液中結晶干擾素α-2的方法。通常用這些方法得到的針狀結晶，用X射線衍射技術難以準確鑒定其特性。Miller等人的文章還提到了“棱狀”結晶干擾素α-2。

一般來說，對干擾素這樣的蛋白質進行結晶的方法是無法預言的。例如，Kung等人的美國專利4,672,108(1987)在第1欄第52-64行特別指出：

“現已建立了多種蛋白質結晶技術，但尚未發現通用的方法，因此許多蛋白質仍未結晶出來。所以，蛋白質的結晶是一門無法預言的技術，需要對許多可供選擇的可能方法作反復試驗。

應用最為廣泛的方法之一，涉及在蛋白質溶液中加入一種結晶劑，通常是一種鹽(例如硫酸銨或檸檬酸銨)或一種有機溶劑(例如乙醇或2-乙基-2，4-戊二醇)。但這些方法并未提供生產人白細胞干擾素結晶的合適手段。”(加了著重號)。

我們現已意外地發現了一種即使在室溫下也能有效地產生高質量結晶干擾素α-2的方法，該方法包括：使干擾素α-2的溶液與一種硫酸鹽溶液平衡，使干擾素α-2溶液變得更濃，從而形成干擾素α-2結晶。最好利用超濾法或透析法，或采用液滴(如懸滴或夾滴)來實現平衡。

干擾素α-2的溶液最好含有一種硫酸鹽，并且該溶液最好與濃度更高的硫酸鹽溶液平衡。該硫酸鹽優選銨鹽、鈣鹽、鎘鹽、鉀鹽、鋰鹽、鎂鹽或鈉鹽，更為優選的是硫酸銨。開始形成結晶時硫酸鹽在結晶干擾素α-2溶液中的濃度最好為約12％至30％飽和，更為優選的是濃度為約15％至25％飽和的硫酸銨。如下面所指出的，平衡步驟開始時硫酸鹽的濃度較低，即約2％至18％飽和。