[發明專利]制備由肝炎病毒因子產生的蛋白質的方法

無效

• 申請號: 89104064.1
• 申請日: 1989-06-16
• 公開（公告）號: CN1048523C
• 公開（公告）日: 2000-01-19
• 發明（設計）人: 格雷戈里·Ｒ·雷耶斯;丹尼爾·Ｗ·布雷德利
• 申請（專利權）人: 基因實驗室技術有限公司;美國政府
• 主分類號: C12N15/51
• 分類號: C12N15/51;C12N15/63
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司
• 代理人: 汪洋,曹恒興

本申請是1988年6月17日提交的208,997號美國申請的后續部分，該申請被作為本文的參考文獻。

本發明涉及重組蛋白、基因和基因探針，更具體地說，涉及由腸道傳播性非甲非乙型肝炎病毒因子產生的這種蛋白和探針，并涉及利用這些蛋白和探針的診斷方法和疫苗應用。

據報導，在亞洲、非洲和印度次大陸，腸道傳播性非甲非乙型(ET-NANB)肝炎病毒因子是許多流行性和零星性肝炎病例的病因。傳染作用通常是通過糞便污染的水體進行，但該病毒也可通過密切的物理接觸傳播。端毒似乎并不會導致慢性感染。通過用收集的糞便分離物感染志愿者，已經證實了ET-NANB病毒的病原學；免疫電鏡(IEM)研究表明，來自感染個體糞便的病毒顆粒直徑為27-34nm。病毒顆粒能與來自不同地理區域感染個體的血清抗體反應，這一現象提示，全球范圍的ET-NANB肝炎中有大部分是由一種病毒因子或類別導致的。在由血液傳播性NANB病毒感染的個體的血清中，沒有觀察到抗體反應，表明兩種NANB型之間具有不同的特異性。

除了血清學差別以外，這兩種NANB型感染還顯示出各自的臨床差別。ET-NANB的特征是急性感染，通常伴隨有發熱和關節痛，以及肝門發炎，還伴隨有肝臟活體解剖樣品中的膽汁阻塞(Arankalle)。癥狀一般在六周內消退。與此相反，血液傳播性NANB在大約50％病例中都是慢性感染。很少觀察到發熱和關節痛，炎癥則主要分布于實質細胞中(Khuroo，1980)。根據對于靈長類宿主的感染性也可區別這兩種病毒因子。ET-NANB能夠傳染犬猴(Cynomolgusmonkeys)，但血液傳播性因子不能。血液傳播性因子比ET-NANB更易傳染黑腥腥(Bradley，1987)。

為了鑒別和克隆與ET-NANB肝炎相關的病毒基因組順序，在全球范圍內已作出了大量努力。努力的目標之一是鑒別病毒及其蛋白產物并確定其特征，這需要有病毒特異性的基因組順序。另一目的是生產重組病毒蛋白，它能夠用于以抗體為基礎的診斷法和疫苗。盡管作出了這些努力，但迄今為止，還沒有成功地鑒別出與ET-NANB肝炎相關的病毒順序，也沒有鑒別或生產出任一種病毒特異性蛋白。

本文引用的相關文獻如下：

?????Arankalle，V.A.，et?al.，The?Lancet，?550(March?12，1988).

?????Bradley，D.W.，et?al.，J?Gen.?Virol.，?69：1(1988).

?????Bradley，D.W.?et?al.，Proc.?Nat.?Acad.?Sci.，USA，84：6277(1987).

?????Gravelle，C.R.?et?al.，J.Infect.Diseases，131：167(1975).

?????Kane，M.A.，et?al.，JAMA，?252：3140(1984).

?????Khuroo，M.S.，Am.J.Med.，48：818(1980).

?????Khuroo，M.S.，et?al.，Am.J.Med.，68：818(1983).

?????Maniatis，T.，et?al.Molecular?Cloning：ALaboratory?Manual，Cold?Spring?Harbor?Laboratory(1982).

?????Seto，B.，et?al.，Lancet，11：941(1984).

?????Sreenivasan，M.A.m?et?al.，J.Gen.Virol.，65：1005(1984).

?????Tabor，E.，et?al.，J.Infect.Dis.，140：789(1979).

本發明提供了新的組合物、組合物的制備方法和應用，所述組合物包括來自ET-NANB病毒因子的病毒蛋白和其片段。制備ET-NANB病毒蛋白的方法包括分離ET-NANB基因組順序，然后將其克隆并在宿主細胞中表達。所產生的重組病毒蛋白可用作診斷劑和疫苗。基因組順序和其片段可用來制備ET-NANB病毒蛋白，并可用作病毒檢測的探針。

圖1顯示了用以獲得克隆的ET-NANB片段和測定其順序的載體構建和操作過程：

圖2A-2B顯示了Southern雜交印跡，其中，使放射性標記的ET-NANB探針與擴增的cDNA片段雜交，所述cDNA片段是用從感染的(I)和非感染的(N)膽汁來源(2A)、以及從感染的(I)和非感染的(N)糞便樣品來源(2B)分離的RNA制備的。