[其他]膦蘇菌素抗性基因

無效

• 申請號: 88102798
• 申請日: 1988-05-13
• 公開（公告）號: CN88102798A
• 公開（公告）日: 1988-11-30
• 發明（設計）人: 迪特·布拉爾;克勞斯·巴特赫;鞠特爾·多恩
• 申請（專利權）人: 赫徹斯特股份公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;A01H1/06;A01N63/00;C02F3/34
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 李瑛

膦蘇菌素（Phosphinothricin）（PTC，2-氨基-4-甲膦基丁酸）是一種谷氨酰胺合成酶抑制劑。PTC是抗生素膦基甲蘇氨酰-丙氨酰-丙氨酸的“結構單位”。該三肽（PTT）具有抗革蘭氏陽性和陰性菌活性，同時具有抗真菌灰綠葡萄孢的活性（Bayer等，Helv.Chim.Acta55，224，1972）。PTT是由綠色產色鏈霉菌Tü494（DSM40736）菌株產生的。

歐洲專利申請（EPA）0173327號描述了PTT的生物合成。其中圖7涉及由吸水鏈霉菌FERM????BP-130（ATCC21705）產生的抗性基因，但並沒有詳細描述其特征。

1987年2月4日出版的Franfurter????Allgemeine????Zeitung的報告的第29頁（自然與科學增刊，左手欄上方）述及有可能從土壤鏈霉菌中分離到負責破壞PTC的基因。

未在先公開的歐洲專利申請（EPA）0，257，542號中提到了來源于上述PTT生產菌綠色產色鏈霉菌DSM60736菌株的PTC抗性基因。

關于PTC和PTT的生產以及這些化合物的抗性，迄今為止只有鏈霉菌已被描述并提出。

細菌中，真菌樣鏈霉菌作為一個大菌屬，在許多方面占有重要地位：鏈霉菌是抗生素的最重要的生產菌，它們形成即使在老化菌落中仍可保留的菌絲體，並常常伸出高度發育的氣生菌絲體;另外，與遺傳操作有關的一個重要特征是，在其DNA中A和T對G和C的比例約為30比70。

現已發現，其他細菌如非真菌樣細菌，特別是革蘭氏陰性菌也表現有PTC抗性。

德國專利2，717，440號述及PTC具有非選擇性的除莠劑作用。可根據其在土壤中的短生物學半壽期來鑒別之，即這種除莠劑在土壤中很容易被微生物迅速修飾或破壞，從而失去除莠作用。已有可能從來自PTC處理過的耕地的土壤樣品中分離出修飾PTC的微生物。也有可能在用誘變劑處理后，由污水淤漿中分離出有PTC抗性的細菌。

本發明涉及膦蘇菌素（PTC）抗性基因，該基因可經選擇有PTC抗性的非真菌樣細菌，提取DNA、構建基因庫、分離PTC抗性克隆、並由這些克隆中分離PTC抗性基因而制得。

本發明特別涉及由非真菌樣細菌中制得的新的PTC抗性基因、含有該基因的細胞特別是植物細胞、以及含該基因的抗PTC的植物。本發明的另一個方面涉及基因在細菌和植物細胞中作為標志物的應用。本發明的其他方面和優選實施方案將在下文中詳細解釋。

圖1顯示了本發明之基因的限制性酶切圖。

圖2顯示了載體pOCAM12，在構建基因庫后，其可用于分離圖1所示的基因。

選擇非真菌類的抗PTC菌，除未確定特征的微生物外，最好是不產孢子的革蘭氏陰性桿菌，特別是假單胞菌屬的需氧微生物和產堿桿菌屬與土壤桿菌屬的假單胞菌樣細菌、腸桿菌屬和沙雷氏桿菌屬的兼性厭氧腸道細菌、以及Cedecea菌屬的細菌。

為本發明之目的，沒有必要對PTC抗性細菌進行精確定性。只要證明其可在富含PTC的選擇培養基中正常生長便足夠了。

一旦確定了適當的種和屬特性，也就有可能很好地確定所說種和屬（其可由寄存單位得到）之菌株的特性，並從中選擇PTC抗性菌株。

已對糞產堿菌和真養產堿菌、Pseudomonas????paucimobilis、Enterobacter????agglomerans、Serratia????plymuthica、根瘤土壤桿菌和Cedecea????Gr.V.的菌株進行了詳盡的特性分析。基于這一知識，便有可能去利用這些細菌，如得自Deutsche????Sammlung????Von????Mikroorganismen（德國微生物保藏中心）的產堿桿菌菌株（寄存號為DSM975或30030）。

亦可在污水處理廠中使用這些類型的PTC抗性細菌或已通過引入本發明的基因而提供了抗PTC抗性的微生物，以破壞生產殘留物或污水中的PTC及其衍生物，或者使用污水處理廠中有用的微生物菌群使其破壞改變之。

按照EP-A0，257，542中所述，負責失活PTC的酶已鑒定為谷氨酸N-乙酰基轉移酶。已分離出了負責這一活性的基因，並已確定具有圖1所示的限制性酶切圖和表1所示的DNA序列。當然，也可以用某種已知方法如亞磷酸鹽法化學合成該DNA序列，並可能按照已知方法來制備經過修飾的基因。

當與適當的宿主特異性調節片段融合后，該基因可使其他對PTC敏感的生物體獲得抗PTC抗性。這一抗性可被用作選擇標志或制得有用的PTC抗性植物。