[其他]抗除草劑植物，其選擇方法及其再生方法

無效

• 申請號: 88102755
• 申請日: 1988-05-12
• 公開（公告）號: CN88102755A
• 公開（公告）日: 1988-11-30
• 發明（設計）人: 岡特·多恩
• 申請（專利權）人: 赫徹斯特股份公司
• 主分類號: A01H1/04
• 分類號: A01H1/04;C12N5/00;C12N5/02;A01N57/12
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 吳大建

用源于未成熟胚的愈傷培養物可再生玉米植物[Green????C.E.，Philips，R.L.Crop.Sci.15，47（1975）;EP160390;EP177738]。但最初只在少數幾種基團型如近交系A188，W64A和Black????mexican????sweet上取得了成功。最初改型的營養培養基可用許多不同的近交系建立起形態生成和胚胎生成的愈傷培養物[Duncan????et????al.，Planta????165，322（1985）]。其中重要的條件是向營養培養基中加氨基酸。

要經過數月或數年才能再生成完整植物的細胞培養物適于突變和變種細胞株的選擇。例如，向培養基中加致毒劑量的除草劑時，某些愈傷分脈仍存活下來，由此即可再生抗除草劑植物。如用誘變劑處理愈傷組織，則可提高突變產量（US4443971）。

除草劑是酶的抑制劑，而酶又參與氨基酸的生物合成，而在培養基含氨基酸，特別是在其合成受到特定除草劑抑制的氨基酸的情況下，除草劑對細胞培養物的除草作用卻很有限。因此，在氨基酸存在下，即到目前為止被認為特別有利于建立和接種可再生的玉米愈傷組織的條件下，難于同時找到可抗阻止氨基酸合成的抑制劑的突變型。

現已出人意料地發現，可在無氨基酸營養培養基中培養植物細胞株。還可在這種營養培養基中用這種細胞株再生植物。這是特別出人意料的，因為氨基酸對愈傷培養物或植物的生長和再生起決定作用。這種培養物可用來選擇抗除草劑細胞株，愈傷培養物或植物。

因此，本發明涉及可靠地選擇能抗氨基酸生物合成抑制劑的植物細胞株的方法，其中在含抑制劑的營養培養基中進行培養，其特征在于，

a）選擇愈傷培養物或細胞懸浮培養物并讓其在無氨基酸的營養培養基中生長，同時又能保持其胚胎生成和形態生成能力，

b）在無氨基酸的含抑制劑營養培養基上培養這些培養物，選擇抗抑制劑的培養物并由此再生出完整的植物。

以下尤其是以其優選實施方案詳述本發明，而本發明保護范圍如權利要求書所述。

用下述本發明方法可培養出能再生的抗除草劑植物優選是單子葉植物特別是谷物細胞株。更優選的是采用玉米細胞株。

為選擇抗除草劑細胞培養物，必須先建立能在無氨基酸培養基上完好繁殖并可以高頻誘發再生植物。為此可在無氨基酸培養基如在改性Murashige Skoog（MS）培養基上進行培養[Physiol.Plant 15，473（1962）]或在改性N₆-培養基上進行培養[Chu C.C.et al，Sci，Sin.16，659（1975）]。這種培養基主要含碳源如蔗糖，葡萄糖，麥芽糖和棉子糖，氮源如銨鹽或硝酸鹽以及專業人員熟知的維生素，激素和無機鹽。

優選的是向有關營養培養基中添加一種或多種可有效影響培養物生長的生理有機酸或其鹽特別是檸檬酸循環酸如檸檬酸，蘋果酸，草乙酸，琥珀酸和丙酮酸或其鹽且優選為鈉鹽和鉀鹽特別是銨鹽。這些添加劑有助于愈傷或細胞懸浮培養物在無氨基酸培養基上生長并且能夠在標準培養條件下經過長時間即至少1-2年的接種而不喪失植物再生能力。因此，這些化合物可代替氨基酸加入營養培養基，其濃度優選為約0.1-10mmol特別是0.5-2mmol。標準培養條件理解為專業人員熟知的條件。如可在15-35℃優選為20-30℃下進行培養，其中可有光照或無光照。轉移期限一般可選為10-30天優選為14-21天，當然這取決于培養物的生長情況。

然后再用能在無氨基酸培養基上進行生長的細胞株選擇抗抑制劑特別是抗除草劑的愈傷培養物和細胞懸浮培養物。采用這些培養物可進行抗基本上所有抑制劑但優選的是抗阻止氨基酸合成的除草劑的選擇。其中優選的是進行抗下式除草劑的選擇

式中各取代基互不關聯，

R¹為羥基或甲基，

R²為羥基，甲基或乙基，

R³為亞氨基甲基，亞羥基甲基或羰基，

R⁴為OH或，其中x為1-5優選為1-2，

n為0-4，優選為0-2。

特別優選的是Glufosinate（Phosphinothricin）或其結構類似物如Bialaphos以及二甲基氧膦基羥基乙酸。若為旋光的，則可用這些化合物的外消旋物或生物活性對映體。