[其他]昆蟲抗性植物

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 88102497
• 申請日: 1988-04-28
• 公開（公告）號: CN88102497A
• 公開（公告）日: 1988-11-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戴維·艾倫·菲殊霍夫;羅伊·李·富克斯;保羅·布魯諾·拉夫力克;施維亞·安·麥克弗森;弗雷德里克·約瑟夫·珀拉克
• 申請（專利權(quán)）人: 孟山都公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N5/00;C12P21/02;A01H1/06
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊松堅

本發(fā)明涉及遺傳工程、生物化學及植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明旨在轉(zhuǎn)化植物細胞以表達一種編碼對鞘翅目昆蟲有毒的蛋白質(zhì)的嵌合基因。

蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，B.t.）是一種形成芽孢的土壤細菌，已知它能產(chǎn)生一種對許多種昆蟲有毒的伴孢晶體蛋白。其中大多數(shù)菌株有抗鱗翅目昆蟲（蛾和蝴蝶）的活性，有幾個菌株據(jù)報道具有抗雙翅目昆蟲（蚊和蠅，參見Aronson et al.1986）的活性。這些菌株中有許多菌株的毒素基因已被克隆，并且這些毒素已在異源宿主中得到表達（Schnepf et al.，1981;Klier et al.，1982）。近年來，蘇云金芽孢桿菌黃粉變種（B.t.var.tenebrionis;B.t.t.，Krieg et al.，1983;Krieg et al.，1984）及蘇云金芽孢桿菌圣地亞哥變種（B.t.var.san diego;B.t.sd.，Herrnstadt et al.，1986）菌株已鑒定為具有抗鞘翅目昆蟲的活性。已克隆了B.t.sd.的毒素基因，但在大腸桿菌（E.coli）中產(chǎn)生的毒素據(jù)報道比來自B.t.sd.晶體的毒素體積大，這意味著此重組B.t.sd.毒素的活性較弱。

對鞘翅目型蘇云金芽孢桿菌蛋白毒素作用敏感的昆蟲包括（但不限于）馬鈴薯葉甲（Leptinotarsa????decemlineata）、棉鈴象（Anthonomus????grandis）、黃粉蟲（Tenebrio????molitor），榆黃葉甲（Pyrrhalta????luteola）及黃瓜十一星葉甲食根亞種（Diabrotica????undecimpunctata????howardi）。

因此，如果能夠轉(zhuǎn)化植物使其以具有殺蟲效力的水平表達鞘翅目型毒素，那么就有可能用遺傳工程方法改造植物使其表現(xiàn)對鞘翅目昆蟲的毒性或耐性。受鞘翅目昆蟲影響的重要農(nóng)作物包括苜蓿、棉花、玉米、馬鈴薯、油菜（canola）、水稻、煙草、番茄、甜菜及向日葵。

盡管某些嵌合基因已在轉(zhuǎn)化的植物細胞和植株中得到表達，但這種表達決非直截了當。具體地說，鱗翅目型B·t·毒素蛋白的表達特別成問題。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，本領(lǐng)域內(nèi)關(guān)于鱗翅目型B·t·毒素蛋白在植物中表達的技術(shù)不能擴展到鞘翅目型B·t·毒素蛋白。這些發(fā)現(xiàn)與先有技術(shù)截然相反。先有技術(shù)認為可用同樣的基因操作在轉(zhuǎn)化植物中獲得這類毒素的有效表達。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種使植物表現(xiàn)出對鞘翅目昆蟲有毒性的遺傳轉(zhuǎn)化方法，它包括以下步驟：

（a）在易受鞘翅目昆蟲侵襲的植物細胞的基因組中插入一個嵌合基因，該嵌合基因包括：

ⅰ）一個啟動子，它在植物細胞中起著引起RNA產(chǎn)生的作用;

ⅱ）一個DNA順序，它引起編碼鞘翅目型蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白的RNA順序的產(chǎn)生;

ⅲ）一個3′非翻譯DNA順序，它在植物細胞中起著使多聚腺苷酸加到RNA順序3′端的作用;

（b）獲得轉(zhuǎn)化的植物細胞;

（c）從已轉(zhuǎn)化的植物細胞再生出對鞘翅目昆蟲有抗性的遺傳轉(zhuǎn)化植物;

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種嵌合植物基因，該嵌合基因包括下列順序：

（a）一個啟動子，它在植物細胞中起著引起RNA產(chǎn)生的作用;

（b）一個DNA順序，它引起編碼鞘翅目型蘇云金芽孢桿菌毒素蛋白的RNA順序的產(chǎn)生;

（c）一個3′非翻譯區(qū)，它在植物細胞中起著使多聚腺苷酸加到RNA順序3′端的作用。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了細菌細胞、轉(zhuǎn)化的植物細胞和植物轉(zhuǎn)化載體，分別含有由上述成分（a）、（b）及（c）構(gòu)成的DNA。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供了一種含上述轉(zhuǎn)化的植物細胞的分化植物，該植物表現(xiàn)對鞘翅目昆蟲的毒性。本發(fā)明還期望獲得能產(chǎn)生上述轉(zhuǎn)化植株的種子。

圖1表示用于分離B·t·t·毒素基因的DNA探針。

圖2表示制備質(zhì)粒pMON5432所用的步驟。

圖3表示在pMON5420和pMON5421中編碼毒素基因的3.0Kb????HindⅢ片段相對于pUC119多聯(lián)接子的定向。

圖4表示測定pMON5420和pMON5421中所含的B·t·t·毒素基因順序所用的方法。

圖5表示編碼644個氨基酸的毒素蛋白的B·t·t·基因的1932bp????ORF的DNA順序以及限制位點的位置。

圖6表示用SDS-PAGE分析觀察到的B·t·t·毒素的條帶。