[其他]由重組體棒狀病毒感染的昆蟲細胞中的人類免疫缺陷病毒的殼膜基因得到的多肽

無效

• 申請號: 87107837
• 申請日: 1987-10-16
• 公開（公告）號: CN87107837A
• 公開（公告）日: 1988-12-21
• 發明（設計）人: 馬克·艾·科克倫;蓋爾·埃·史密斯;富蘭克林·沃爾沃維斯
• 申請（專利權）人: 微基因系統公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P21/02;G01N33/569
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊九昌

獲得性免疫缺陷綜合癥（愛滋病）是一種有全球重要性的病毒性疾病。這種疾病的病原因子是稱為人類免疫缺陷病毒（HIV）的棒狀病毒，也有人稱之為淋巴結病病毒（LAV）（Barre-Sinoussi等，1983年）、人類T細胞白血病Ⅲ型病毒（HTLV-Ⅲ）（Popovic等，1984）或愛滋病相關病毒（ARV）（Levy等，1984）。根據分子克隆的完全核苷酸序列以及病毒蛋白的直接序列的分析，已闡明了幾種愛滋病病毒的結構和基因組織。

在發展愛滋病疫苗和診斷技術中，殼膜蛋白是最有希望的候選物（Francis等，1985）。在愛滋病病人血清中通常檢測到抗殼膜糖蛋白抗體（Robey等，1985）。此外，殼膜糖蛋白代表了愛滋病病毒的主要靶抗原（Barin等，1985）。

愛滋病有效的疫苗的生產取決于大量制造安全抗原的能力。這種安全抗原在注入人體時即可刺激機體的保護性免疫力，因為已發現DNA重組技術可以大量制造安全而經濟的免疫原，故其代表了抗原生產的最佳選擇。選擇使用哪一種重組系統（細菌、酵母或其它真核細胞）將考慮以下方面：

可通過糖基化作用和裂解對HIV的殼膜糖蛋白進行特異性加工處理。該重組系統應能以預期的方式加工基因產物。

細菌和酵母細胞不能有效地糖基化它們的表達蛋白質。

雖然哺乳動物細胞似乎是適宜的表達載體，但它們卻有包含許多不需要的免疫反應性抗原的缺點，而且還存在著掩匿外來因子的危險。

棒狀病毒表達系統提供了生產有效的HIV殼膜免疫原的一個有吸引力和可行的機會。

棒狀病毒可被用作在培養的昆蟲細胞中生產重組蛋白的高效真核克隆和表達載體。

棒狀病毒不止具有用作真核克隆和表達載體所必須的各種條件，它們由于狹窄的宿主范圍-只限于節肢動物，所以很安全;它們能夠容納大量的外源DNA;它們的細胞培養物系統是安全的、非轉化的和有效的;它們具有高度有效的多角體啟動子（polyhedrin????promoter），它比病毒感染的真核細胞中任何其他已知啟動子有更大的活性。

棒狀病毒系統在生產用于診斷程序的多肽方面也有很大優越性。許多人體和動物一般都具有對細菌、酵母及外源組織相容性抗原起作用的抗體，由于這些抗體與各個表達系統中產生的制劑內的污染細胞、酵母和哺乳動物細胞蛋白質產生假陽性反應，所以它們的存在會降低診斷方法的可靠性。然而，人類和動物不大可能有與鱗翅動物細胞或棒狀病毒抗原產生免疫接觸的既往史。因此，在這種系統內生產重組蛋白質，使用鱗翅目動物細胞和棒狀病毒很可能沒有可被正常存在于人或動物體內的抗體識別的污染抗原問題。所以說，在診斷方法中使用由該系統生產的重組抗原時，不會因鱗翅目動物細胞源或棒狀病毒源的污染物導致假陽性反應。

本發明的一個實施方案中使用了棒狀病毒Autographa????californica核多角體病毒（AcMNPV）。用于表達的啟動子序列為得自該病毒的多角體（OCC）基因的啟動子序列。AcMNPV和重組體病毒材料在Spodoptera frugiperda（草地貪夜蛾）細胞中維持。所構建的重組體應將Pn基因刪除，這樣就使得重組體病毒為OCC^-。從而便能根據噬菌斑形態來容易地鑒定重組體病毒，一經分離了重組體棒狀病毒，即可用于感染任何一個作為培養細胞系或一個完整昆蟲的一部分而保留的受納或半受納細胞群體。

插入載體的構建

外來蛋白質編碼序列在棒狀病毒載體中的克隆和表達，要求該編碼序列與多角體啟動子和上游序列連成一線，而且在另一側與截短了的多角體編碼序列連成一線，結果使得與棒狀病毒基因組的同系重組導致與多角體啟動子和失活的多角體基因連成一線的外來編碼序列的轉移。

因此，設計了各種用于愛滋病env基因構建的插入載體。下述的每種插入載體用來提供ATG轉譯起始密碼子，外來序列向這些載體內的插入必須設計成能維持由起始密碼子確定的轉譯讀碼正確地通過外來序列。

以下的參考附圖對本發明的實施進行了詳細描述。

圖1為LAV-1a分離物之全長殼膜基因的核苷酸序列，同時給出了推定的氨基酸序列。序列資料得自于GENBANK。核苷酸的編號是由假定的ATG起始密碼子的第一個核苷酸開始的。氨基酸是從ATG起始密碼子編號的。圖中顯示了相應于信號肽細胞外糖蛋白（gp120）及跨膜糖蛋白（gp41）的區域，連同提出的肽裂解位點及天冬酰胺聯系的糖基化位點。在核苷酸序列的下面列出了適當的限制性酶切點。