[其他]體內(nèi)細胞示蹤

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 87107218
• 申請日: 1987-10-30
• 公開（公告）號: CN87107218A
• 公開（公告）日: 1988-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 保羅·卡爾·霍蘭;休·埃倫·斯萊扎克
• 申請（專利權(quán)）人: 史密絲克萊恩貝克曼公司
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;A61K49/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊厚昌

本發(fā)明涉及體內(nèi)示蹤細胞的方法及測定體內(nèi)細胞壽命的方法。

體內(nèi)細胞示蹤及壽命測定需要用一個在細胞內(nèi)穩(wěn)定的標(biāo)志來標(biāo)記細胞，即，該標(biāo)志不會從細胞中丟失也不顯著地影響細胞功能。現(xiàn)有可用的標(biāo)志不能提供這些必需的特性。例如，熒光抗體因其容易從細胞上解離而不適用。其它可能的標(biāo)志因其干擾細胞功能而不能使用。

花青染料已用于各種生物學(xué)用途。二氧羰花青染料已用來進行白細胞分類計數(shù)。Gunter????Valet，Max????Planck????Ges????Wissensch;專利登記號84-102307/17，《通過選擇性染色及測量體積和熒光同時定量測定血細胞》。但在這些研究中用的染料是短鏈羰花青染料（少于10個碳）并對膜電位的變化起反應(yīng)。而且，短鏈羰花青染料進入細胞的線粒體，是有細胞毒性的，并且當(dāng)洗滌細胞時，不論細胞膜電位是否改變，這些染料都容易滲漏出細胞。在許多其它生物學(xué)試驗中用其它短脂肪鏈花青染料。但短鏈分子會對膜電位起反應(yīng)并穿過細胞膜，進入線粒體。H.M.Shapiro，美國專利號4，343，782，1982年8月10日。短鏈染料也對細胞有毒性而不能用于體內(nèi)示蹤細胞。

三羰花青染料（Fox，I.J.，et????al.，proc.Mayo????Clinic，32：478-484，1957）和伊文思藍（Evans-Blue）染料（SChad，H.，et????al.，Pfluegers????Arch.Eur.J.Physiol.，370（2）：139-144，1977）已通過釋釋法用于體內(nèi)測定心輸出量。Dow（Dow，P.，Physiol.Rev.，36：77-102，1956）將此方法描述為，在肺的靜脈側(cè)注射已知量的某種血管內(nèi)指示劑，測定該指示劑的動脈濃度的時間過程，以確定在注射和取樣兩點間的容量。這些染料不用來染色細胞。

本發(fā)明是體內(nèi)示蹤細胞和測定體內(nèi)細胞壽命的新方法。根據(jù)本發(fā)明的細胞示蹤新方法，首先將細胞用花青類染料標(biāo)記，然后將其注射給受試者，花青類染料用來確定細胞的位置。在另一個實施方案中，通過測量標(biāo)記細胞消失的速率來確定細胞壽命。

在本發(fā)明的體內(nèi)示蹤細胞及測定體內(nèi)細胞壽命的方法中，用花青類染料標(biāo)記細胞。在此，具有下列結(jié)構(gòu)的化合物稱為花青類染料：

其中：

y是氧、硫、亞甲基或烷基取代的亞甲基;

m是0-3;

n是12-22。

此處所用的烷基取代的亞甲基系指以任何組合的甲基、乙基或丙基取代的單或雙取代的亞甲基。

上述結(jié)構(gòu)的化合物可用下列通用的速記式來表示：

DiYC_n（2m+1）

Sims，P.J.，et????al.，Biochem，13：3315（1974）。這樣，如該化合物中Y是硫，有三個碳連接兩個環(huán)，并有兩個十四碳的脂肪鏈，則表示為DiSC₁₄（3）。類似地，DiIC₁₄（5）表示該化合物中Y是異丙基，有五個碳連接兩個環(huán)，并有兩個十四碳的脂肪鏈。

包括在此處稱為花青類染料的化合物，是具有一個或多個取代的上述結(jié)構(gòu)的化合物，假定這樣的取代化合物至少在標(biāo)記所需的時間內(nèi)溶于細胞標(biāo)記介質(zhì)，并且有足夠高的膜分配系數(shù)以保持與標(biāo)記的細胞膜相連。這樣的化合物還必須在標(biāo)記所需的濃度下不顯著影響細胞的活性。如下所述測定染料在細胞標(biāo)記介質(zhì)中的溶解度：通過將花青類染料分散在標(biāo)記介質(zhì)中，用常規(guī)熒光分光光度技術(shù)測量熒光強度隨時間的變化。熒光強度減弱表明染料沉淀并附著于容器壁上。例如，可用已知的流式細胞儀方法監(jiān)測標(biāo)記后注入供體動物的紅血細胞的熒光強度，測定染料是否保持同細胞膜相連，注射后基本恒定的標(biāo)記細胞的熒光強度，可證實染料在細胞膜中的穩(wěn)定性。

摻入一個可用磁共振成象技術(shù)檢測的原子的上述結(jié)構(gòu)的化合物，也包括在此處稱為花青類染料的化合物中。這樣的化合物可用已知技術(shù)制備，例如，把氟原子摻入脂肪鏈的一個甲基中。用一伽馬放射體如¹²⁵I標(biāo)記的上述結(jié)構(gòu)的化合物在此也歸入花青類染料。

本發(fā)明中所用的花青類染料可從各種來源如Molecular????Probe，Inc.，Eugene，Oregon買到，也可用已知的合成方法從現(xiàn)有的起始物質(zhì)制備。Hamer，F(xiàn).M.，《花青染料和有關(guān)化合物》，Interscience????Publishers（1964）。