[其他]轉氨酶基因ILVE的克隆和應用

無效

• 申請號: 87107205
• 申請日: 1987-10-28
• 公開（公告）號: CN87107205A
• 公開（公告）日: 1988-07-20
• 發明（設計）人: 魯迪格·馬奎特;約翰·森;翰斯·馬希斯·迪格;格哈德·沃納;馬蒂恩·羅賓森;安德魯·多赫蒂
• 申請（專利權）人: 赫徹斯特股份公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P13/00;//;C12R119)
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 顧柏棣,李瑛

體內合成脂肪族氨基酸的最后步驟包括借助氨基轉移酶使相應的酮前體產生胺化。雖然各種轉氨酶均可完成轉氨基反應，生成脂族氨基酸，但這種作用在細胞內主要是靠脂族轉氨酶完成的。遺傳學中所用的脂族轉氨酶基因的縮寫符號是iLvE（Umbarger，Ann.Rev.Biochemistry????47（1978），533-606）。對于大腸桿菌K12來說，已確切知道了該基因在“細菌染色體”上的定位，其基因產物為E.C.2.6.1.42號（Bachmann等，Microbiological????Reviews????44（1980），1-56）。

歐洲專利申請（EP-A）0116860號描述了分離大腸桿菌K12中iLvE基因及將這種氨基轉移酶基因克隆到一個多拷貝質粒上的方法，沒有說明被克隆的iLvE基因產物的生物活性。EP-A????0152275號中提到通過克隆iLvE基因來提高酶的活性，但沒有關于增加脂族氨基酸產率的資料。

現已發現，分離大腸桿菌ATCC11303中的iLvE基因，並將其克隆到一個多拷貝質粒中，再用這一質粒轉化始發菌株之后，可使該氨基酸的產率至少增加3到5倍。

因此，本發明涉及：

1、一個染色體外的復制成分，其含有自大腸桿菌ATCC11303分離的iLvE基因。

2、由（1）指出的“染色體外”復制成分，在脂族氨基轉移酶合成中的應用。

3、由（1）所規定的“染色體外”復制成分在微生物體內過量產生分枝鏈氨基酸中的應用，包括

a）將“染色體外”復制成分引入微生物內;

b）在該微生物內表達iLvE基因並合成有活性的脂族轉氨酶;

c）由轉氨基酶與相應的酮前體產生胺化作用。

本發明在說明書的詳述部分及權利要求書中給以更充分的說明。

該基因不僅可用于野生型大腸桿菌ATCC????11303，而且還可用于其變種和突變體。例如，它可用于由已知方法（E.Adelberg等Biochem.Biophys.Res.Comm.18，788（1965））致突變的菌株以及根據過量產生分枝鏈氨基酸而選擇的菌株。大腸桿菌ATCC????11303中iLvE基因編碼的脂族氨基轉移酶，可借助這種酶自谷氨酸鹽轉移氨基，由相關酮前體合成纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸。此外，亦可使用脂族轉氨酶合成苯丙氨酸和谷氨酸。除iLvE基因產物外，還發現了大腸桿菌細胞中的其他轉氨酶基因的產物。

例如，芳族轉氨酶是tyrB基因的產物，可催化苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的合成，aspC基因的產物催化天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸的合成。然而，上述的轉氨酶也在其它族的氨基酸合成中顯示微弱的活性。

為了進一步增加分枝鏈氨基酸的合成，而克隆了編碼脂族氨基轉移酶的iLvE基因。先分離大腸桿菌ATCC11303的DNA，部分消化該DNA之后，將所得的20-30Kb的片段連接到有復制子的裝配型質粒中（該質粒具有廣泛的宿主），並包裹在λ噬菌體的頭部。裝配型質粒最好選用pIMS????6026。該質粒是由裝配型質粒pLAFR????1（ATCC37167）衍生來的就是將編碼有轉座子Tn????903的卡那霉素抗性基因的商品EcoR1片段（Pharmacia，Uppsala，Sweden）克隆到pLAFR1的單一EcoR1切點中。因BamHJ切點兩側鄰接2個EcoR1切點，用BamH1酶切刪去EcoR1片段的大部分，保留作為插入部分的短DNA片斷。這個不存在于裝配型質粒pLAFR????1上的BamHI切點可用于克隆。將適當配制的大腸桿菌DG????30懸液與已包裝的裝配型質粒保溫，將裝配型質粒引入微生物體內。大腸桿菌DG30缺少三種轉氨酶aspC、iLvE和tyrB。因此，盡管該菌株能在完全培養基上生長，但在基礎培養基上生長須添加它們不能合成的各種氨基酸。由于適當地選擇培養基，有助于檢測該菌株是否已由外界攝入的DNA來彌補其染色體合成特殊轉氨酶的缺陷。iLvE基因的引入是由大腸桿菌DG????30在無酪氨酸基礎培養基上生長而確定的。只有能通過攝入含有aspC、tyrB或iLvE的DNA以補足其染色體合成酪氨酸的缺陷，且來源于大腸桿菌菌株ATCC????11303的克隆才能在這種培養基上生長。由基因aspC、tyrB和iLvE編碼的三種轉氨酶的區別在于它們的底物不同-盡管所有這三種轉氨酶都能催化酪氨酸的生成。