[其他]酰基載體蛋白-DNA序列及合成

無效

• 申請號: 87106119
• 申請日: 1987-07-31
• 公開（公告）號: CN87106119A
• 公開（公告）日: 1988-04-27
• 發明（設計）人: 讓·C·克里;維·C·克瑙夫
• 申請（專利權）人: 加利福尼亞基因公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;A01H1/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 林玉貞

本申請是1986年7月31日提交的美國專利申請891529號的后續部分。

酰基載體蛋白是于蛋白質可被分離作體外使用，或者可使蛋白于細胞內被轉移到葉綠體或與體內修變脂肪酸產生有關之細胞器內的條件下被轉錄的。本發明所提供的構建物可在種子組織中使用種子特異性啟動子表達酰基載體蛋白。

植物為食品原料和食物成品提供了豐富的來源。植物脂肪酸可廣泛用于多種工業目的，如作為植物油用于烹調，用作潤滑劑以及在醇酸樹脂中用作特殊化學品等。大部分植物脂肪酸為18碳原子的，通常只有少數脂肪酸具有16個以下的碳原子。就許多應用目的來說，期望具有8至14個脂肪酸的脂肪酸。為此，在建立生產其中大部分脂肪酸為14或少于14碳原子之植物油的方法上集中了相當大的興趣。

為達到這一目的，必須改變導致脂肪酸生成並使之伸長為較高級脂肪酸之代謝途徑的組成成分。為此，必須能夠產生一種或多種脂肪酸代謝鏈上的成分，並借以改變植物代謝過程。此外，脂肪酸代謝途徑中的個別成分還可能具有重要的工業應用價值。

Kuo和Ohlrogge（Archives????of????Biochem.and????Biophys.（1984）234：290-296）描述了菠菜酰基載體蛋白的一級結構。Ohlrogge和Kuo（J.Biol.Chem.（1985）260：8032-8037）報導了在不同組織中有不同表達的酰基載體蛋白的不同異構體。Crouch等人（J.Mol.Appl.Genet.（1983）2：273-283）報導了編碼napin蛋白之cDNA的合成。

本發明提供了用于表達植物酰基載體蛋白的DNA構建物。特殊構建物是使用在種子成熟期間的植物胚胎中導致表達的轉錄起始區制成的。可通過改變參予脂肪酸生成之代謝途徑的葉綠體或相關細胞器中的組成成分來調節脂肪酸的量和組成。

本發明提供了生產酰基載體蛋白的方法及成分，其中酰基載體蛋白作為一種體外使用的或連同植物種子生成的終產物，可用以修變體內脂肪酸的表達。為此目的，須制備DNA構建物，其中是將編碼植物酰基載體蛋白的序列連接到在預期宿主中有表達酰基載體蛋白之功能的轉錄起始和終止調節區上。

該表達構建物在轉錄的5′-3′方向上提供了一個轉錄起始調節區（其為結構性的或調節性的）、一個編碼酰基載體蛋白之至少一種功能性蛋白的開放讀碼，期望包括一個用于轉位到葉綠體上作體內使用的轉換肽序列，以及一個在適當的宿主中有功能活性的轉錄終止調節區。

調節區將根據所用宿主而有所不同。當在原核或真核微生物，特別是單細胞宿主內表達時，可使用多種結構性的或可調節的啟動子。在這些情況下，制備酰基載體蛋白的主要目的是將此酰基載體蛋白于體外使用。

大多數情況下，構建物將包括在植物中有功能活性的調節區，用以提高酰基載體蛋白的產生，進而借以提高和/或修變脂肪酸組成。

所用的編碼序列可得自于天然來源，亦可以是合成的，或者以此兩種途徑得到的。為從天然來源獲得基因，可使用多種植物或細菌作為基因的來源。這些植物包括菠菜、蕓苔屬植物如油菜或甘藍型油菜、椰子、棉花、紅花、向日葵、萼距花等。用以獲得基因的各種方法包括制備基因組成cDNA文庫。可基于酰基載體蛋白的氨基酸序列來制備探針。因為不同來源的酰基載體蛋白之間存在有相當程度的免疫交叉反應性，故可利用原核和真核生物的多克隆抗體自某特殊來源中分離酰基載體蛋白，並進一步用于自其它植物來源分離酰基載體蛋白。之后測定整個的或部分的酰基載體蛋白序列，並基于肽序列設計探針。如只測得部分DNA序列，該部分序列即可滿足需要，或者移動基因以確保得到整個編碼序列。

一旦得到了預期的序列，即可以各種方法操縱之。當序列包括非編碼的側接區時，可使用核酸酶如Bal31切斷側翼區，亦可用限制性核酸內切酶作限制性酶切，或者使用體外誘變、引物修復來進行修飾，或者用其它方法向序列內引入突變或損傷。這樣即在天然存在的序列上完成了轉換、顛換、缺失和插入。此外，可以合成全部或部分序列，其中可改變一個或多個密碼子以提供修變了的氨基酸序列，或者引入一個或多個密碼子的突變以提供方便的限制性酶切點或達到其它與構建或表達有關的目的。可進一步使用合成的接合物或連接子，向基因內引入一個或多個方便的限制性酶切點。

酰基載體蛋白可以是任何一種可見于某特殊宿主內的同工酶，如由Ohlrogge和Kuo定名的見于菠菜中的ACP-Ⅰ和ACP-Ⅱ（見上述文獻），或者見于其它植物宿主內的其類似物。