[其他]同位素標記蛋白質抗原純化新工藝

無效

• 申請號: 87102688
• 申請日: 1987-04-08
• 公開（公告）號: CN87102688A
• 公開（公告）日: 1988-10-26
• 發明（設計）人: 富繼義
• 申請（專利權）人: 白求恩醫科大學基礎醫學部
• 主分類號: G01N33/534
• 分類號: G01N33/534
• 代理公司: 吉林省專利服務中心
• 代理人: 劉玉璠

本發明屬生物化學領域，是放射免疫測定藥盒制備中，同位素標記的蛋白質抗原純化的新工藝。

在制備放射免疫測定（RIA）藥盒時，使用¹²⁵I等同位素標記蛋白質抗原常會使蛋白質發生降解，使標記后的蛋白質抗原純度下降，達不到較高的純度，直接影響RIA的質量和測定的準確性。如果標記抗原與過量抗體的結合率低于80%，RIA則不能建立。

本發明的目的是建立一種使標記后的蛋白質抗原純度增高，而且簡便，快速純化蛋白質抗原的新工藝方法。

本發明的技術構思特點是：首先采用常規的聚丙烯酰胺凝膠平板電泳技術，使標記蛋白質抗原純化到電泳純水平。然后用放射自顯影技術在平板凝膠上準確地顯示標記蛋白質的位置。並把相當位置的凝膠裁割下來備用。最后用電泳法將凝膠上標記的蛋白質洗脫下來，收集、分裝。

本發明的工藝分三步：

一、同位素標記蛋白質抗原的平板電泳：

使用常規的垂直或水平聚丙烯酰胺凝膠平板電泳，也可以使用十二烷基磺酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠平板電泳和等電聚焦平板電泳。樣品（如白細胞三烯A₄水解酶）與2-3倍體積的樣品緩沖液混合，然后將樣品分為3-10份，每份量在50微升以下，把每份樣品分別加入凝膠的加樣井中。使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳時，應使用雙層膠技術，即在7-15%凝膠（分離膠）的上面加一層1-2cm高的2.0-4.0%凝膠（樣品膠），以使樣品濃縮后進入分離膠，可提高分辯率，提高蛋白質抗原純化程度。加入樣品后，通直流電2毫安;當指示色帶進入分離膠后，電流提高至4毫安;當指示色帶到達凝膠底端時，停止電泳。電泳時間約4小時。

二、標記抗原的放射自顯影定位：

將電泳后的平板凝膠取下，包一層保護膜，在暗室內取相應尺寸的χ光底片一塊，放在凝膠下面，固定在暗盒中曝光（曝光時間隨同位素種類和使用劑量而異）。底片經顯影、定影、清晰地顯示標記蛋白質的位置。圖1是放射自顯影的定位凝膠圖。〔1〕為所需要的蛋白質在凝膠上顯示的條帶。〔2〕為降解蛋白質和雜質的條帶。將所需要的蛋白質條帶〔1〕裁割下來，置于冰箱中備用。

三、標記蛋白質抗原的電泳洗脫：

圖2是同位素標記蛋白質抗原的電泳洗脫圖。〔1〕為電泳槽，（20×10×5cm），〔2〕電極，〔3〕緩沖液Ⅰ〔5毫克分子，三羥甲氨基甲烷（triS）〕，（2.5毫克分子醋酸，PH8.6），〔4〕為透析袋，〔5〕緩沖液Ⅱ（緩沖劑Ⅰ+0.05%牛血清白蛋白），〔6〕為凝膠塊。

電泳槽內盛滿緩沖液Ⅰ，取直徑為1-2cm的透析袋一段，于緩沖液Ⅰ中浸泡3-10分鐘，將透析袋內裝滿緩沖液Ⅱ，同時裝入含有同位素標記蛋白質抗原的凝膠塊，扎緊透析袋，以系帶固定于電泳槽上，使透析袋與電極平行。通過穩壓直流電200伏，電泳1小時左右，電泳后將透析袋中含有同位素標記抗原的緩沖液Ⅱ，吸出、分裝，純化過程即完成。

以白細胞三烯A₄水解酶（LTA₄H）放射免疫測定藥盒制備中用1¹²⁵Ⅰ標記LTA₄H的純化為例：

取¹²⁵I-LTA₄H5微克，100微升，比放射強度120微居里/微克。樣品分子量70，000道爾頓，¹²⁵I標記前，樣品純度為90%以上，標記后與過量抗體的結合率為68%，（使用抗LTA₄H兔抗血清，1∶10稀釋，培育48小時，4℃，加入1∶5羊抗兔免疫球蛋白抗血清，培育24小時，4℃，離心后分別測上清液與沉渣的放射活性，計算出結合率）。

1、采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳：

¹²⁵I-LTA₄H100微升，混入300微升樣品緩沖液，將樣品分為10份，加入凝膠的樣品井中。樣品膠為3.0%聚丙烯酰胺，分離膠為10%，采用陰離子電泳系統，電極緩沖液為三羥甲氨基甲烷（triS）3.0克，甘氨酸14.4克，SDS1.0克，加水至1升，pH8.8，加入樣品后，電泳槽的上槽接負極，下槽接正極，通直流電2毫安1小時，樣品色帶進入分離膠后，電流加至4毫安，2-3小時，色帶到達凝膠底端，停止電泳。