[其他]初級細胞的永久化

無效

• 申請號: 87102457
• 申請日: 1987-02-28
• 公開（公告）號: CN87102457A
• 公開（公告）日: 1988-01-13
• 發明（設計）人: 愛德華·馬克·亨利;茲登卡·勒德米拉·喬納克;帕特里克·西蒙·雅克·馬希
• 申請（專利權）人: 史密絲克萊恩貝克曼公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊九昌

此申請為1986年2月28日提交的835，089號待批申請的繼續部分。

本發明是關于以致癌基團DNA/致癌基因轉染初級細胞，應用電穿孔技術將此DNA轉移到這些細胞中以生產永久化初級細胞的一種方法。

將DNA轉染到哺乳動物細胞，在基因表達和調節的研究中，作出了重要的貢獻。這一技術有助于發現新的基因，而分子探針則對其并不適用。慣常引導基因進入細胞的種種方法，可分為自然的和人工的兩個系統。

“自然的”轉染是通過完整的（或經遺傳操縱處理的）病毒感染細胞來完成的。來自病毒（DNA，RNA）的遺傳信息可被整合到宿主細胞DNA中，結果導致縮主細胞的轉化作用。

“人工的”轉染是在試管中操作處理DNA并將其導入不同起源的完整細胞，通常用化學的或手工的方法來完成。若干技術已發展到引導DNA進入體細胞中。這些技術可分為下述五種，依靠這些不同的方法將大分子轉移到受體細胞內：

1.微量注射法〔Graessmann等，Hoppe-seyler′s????Z????Physiol.Chem.，352，527-532，（1971）;Capecchi，Cell，22，470-488（1980）〕。

2.載體介導的轉移

一、紅細胞影〔Furusawa等，Methods????in????Cell????Biol.，14，17-80，（1976）〕。

-脂質體〔Poste等，細胞生物學方法，（Method????in????Cell????Biol.，14，33-71（1976）;Gregoriadis等Nature，224，170-172（1973）〕

-重建的仙臺病毒被膜〔Loyter等，Exp.Cell????Res.，139，223-234（1983）〕。

3.借助促進劑轉移

-磷酸鈣〔Graham等，Virology，52，456-467，（1973）〕。

-磷酸鈣/聚乙二醇-二甲亞砜（DMSO）震蕩（Shock）

〔Jonak等，“Monoclonal????Antibodies????and????Functional????Cell????Lines（Progress????and????Applications），”Plerum????Press，418-422，（1984）〕。

-DEAE-葡聚糖〔Graham，Adv.Cancer????Res.，25，1-51，（1977）〕。

-聚乙二醇/蔗糖震蕩〔Chu等，Gene，13，197-202（1981）〕。

4.激光微光束〔Tsukakoshi等，Applied????Physics????B.，35，2284-2289，（1984）〕。

5.電穿孔（electroporation）〔Neumann等，Embo.J.，1，841-845，（1982）;Potter等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81，7161-7165，（1984）〕

這些技術已用于引導DNA，RNA，蛋白質，脂質，藥物，小分子以及細胞器和病毒顆粒進入體細胞。每一種技術都有其使用限制，而且某些生物學問題只有使用特定方法才得以最好的解決。

DNA介導的基因轉移，通常是由各種改進的磷酸鈣-DNA沉淀技術完成的。此方法需有磷酸鈣-DNA-共沉淀物的形成（45分鐘）和將受體細胞與共沉淀物作較長時間保溫（2小時）。之后經細胞內吞的類似過程收集沉淀物〔Loyter等，Ciba????Found.，symp.，103，163-175（1982）〕。此技術需要應用具有胞吞潛力的成纖維細胞起源的特異細胞，從而限制了它的應用。

各種類型細胞都有特異的效率并借以使之得以被轉染。盡管有這些區別，但各種不同類型的細胞均已成功地用于轉染。這些細胞包括正常細胞如淋巴細胞，此淋巴細胞是在懸浮液中使用磷酸鈣DNA共沉淀/聚乙二醇-DMSO技術被轉染的〔Jonak等，Hybridoma，3，107-118（1984）〕。