[其他]從重組體宿主產生抑肽酶同系物及其制造方法，表達載體、重組體宿主和藥物應用

無效

• 申請號: 87102412
• 申請日: 1987-03-26
• 公開（公告）號: CN87102412A
• 公開（公告）日: 1987-10-07
• 發明（設計）人: 厄恩斯特-奧古斯特·奧爾斯沃爾德;沃納·施羅德;尤金·施納貝爾;沃爾夫岡·布倫斯;格爾德·萊因哈特;邁克爾·科蒂克
• 申請（專利權）人: 拜爾公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N9/48;C12P21/02
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 曹恒興,羅宏

本發明涉及抑肽酶同系物及其用重組體DNA技術的制造方法。

本文所述化學合成的DNA分子，其特征為新的多肽或多肽的DNA順序編碼，實質上與抑肽酶或抑肽酶同系物的氨基酸順序及組合物一致，且具有抑肽酶或抑肽酶同系物的生物活性。

眾所周知，抑肽酶是由58種氨基酸組成的肽，具有抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血漿酶和激肽釋放酶的作用。這是一種基本的蛋白酶抑制因子，取自牛的臟器，是一種有價值的藥物，又名Trasylol（抑肽酶），用來治療各種疾病，如高溶解纖維蛋白原的出血和外傷出血的休克（參閱H.Fritz和G.Wunderer，1983年，《藥物研究》33期，479～494頁）。

業已證明，抑肽酶的同系物與抑肽酶相比在15位上是其它氨基酸，而不是賴氨酸，它是有飾變作用和療效作用的有效蛋白酶抑制劑（德國專利DE-OS????3339693號;H.R.溫澤爾等1985年在《肽和蛋白質化學》3卷）。這些抑肽酶同系物對胰和白細胞中彈性蛋白酶，以及組織蛋白酶G有強烈的抑制作用。

在急性的、慢性的破壞結締組織，損害器壁，壞死病變和肺部組織變質的炎癥中，胰腺彈性蛋白酶（胰腺炎）、血漿彈性蛋白酶（關節硬化）、白細胞彈性蛋白酶的過度釋放引起的疾病，可用這種抑肽酶同系物治療由溶酶體酶特別是白細胞彈性蛋白酶在由免疫處理引起的炎性反應中，例如風濕性關節炎中起著同樣重要的作用。

雖然可從牛的臟器以及通過牛胰蛋白酶抑制因子（Tschesche，M.，Wenzel，M.，Schmuck，R.，Schnab，E.德國專利說明書DE????3339693Al從15.05.58起）的半合成轉化得到抑肽酶和抑肽酶同系物，但產量較少。

可見，重組體DNA及有關技術的應用是提供必要的大量高質量抑肽酶同系物的有效方法。目的是生產抑肽酶同系物，及生物活性，宿主生物體是用重組體DNA技術的產品。

在微生物中，異種DNA的表達方法是熟知的。

已知氨基酸順序的多肽DNA編碼的制備，可用基因組DNA順序、與mRNA互補的cDNA順序或根據遺傳密碼及制備合成基因的選擇密碼子。

從牛胰腺的胰蛋白酶抑制因子基因中牛基因組克隆的部分DNA順序的克隆已由S.Anderson和I.B.Kingston（1983年，Proc.Natl.Aead.Sci.USA.80卷，6838～6842頁）說明了牛胰腺胰蛋白酶抑制因子（BPT1）基因組克隆的特征。

近來已把BPT1和牛脾抑制因子Ⅱ的大片段牛基因組編碼編成順序，已由Kingston，I.B.和Anderson，S.發表（1986年，《Biochem.J.》233期，443～450頁）。

本發明的目的是提供抑肽酶同系物、及其核酸編碼、結合核酸和其它轉化細胞的載體，以及獲得抑肽酶同系物的方法。

對于本發明的目的，最有利條件是以恰當設計制備合成基因以及可以廣泛應用的選擇密碼子。

特別是這種情況，構建包括DNA編碼組或由限制酶的獨特識別部位限定的DNA組的合成主導基因。這種基因設計在DNA編碼組內，可使全部DNA順序容易飾變或突變。

由重組體DNA技術制備抑肽酶同系物，如Val-15-、Ile-15-、Leu-15-、Phe-15-和Ala-15-、Arg-15、Gly-15、Ser-15、Trp-15、Tyr-15、單獨抑肽酶，或與在52位上由Glu、Leu、Val、Arg或Thr取代的相結合，業已發現與已知的抑肽酶及其同系物是等同的，在52位上有Met，它們的生產方法將一起介紹。取代Met-52，可生產抑肽酶和抑肽酶同系物，其中在融合多肽的Met位上，用溴化氰把遺傳工程的融合多肽切斷。

還介紹了這種同系物的合成DNA編碼，包括表達該同系物結構基因的重組體質粒，以及由重組體質粒轉化的大腸桿菌（E.coli）。

下文說明編碼抑肽酶和抑肽酶同系物的DNA片段的構建和選擇方案。

已知蛋白質順序及抑肽酶和抑肽酶同系物的遺傳密碼用來確定這種多肽的DNA順序的編碼。

遺傳密碼的簡并性允許在任何給定的氨基酸順序的密碼子選擇中有很大的靈活性。

測定標示這種蛋白質的氨基酸順序的密碼子中所有可能的堿基取代。與此相應可測定定位在合理的DNA順序內全部潛在限制性部位。

通過下述依據指導主導基因的密碼子選擇：首先，選擇密碼子和片段，設計片段組合，以避免不合適的片段互補性。

其次，富集A-T堿基對的范圍，避免用早期轉錄的末端解決問題。