[其他]與甲醇和葡萄糖相應答的酵母菌調節區

無效

• 申請號: 87101797
• 申請日: 1987-03-10
• 公開（公告）號: CN87101797A
• 公開（公告）日: 1987-10-21
• 發明（設計）人: 理查德·哥爾登·布克霍爾茨
• 申請（專利權）人: 菲利普石油公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;//;C12R185)
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 辛敏忠

本發明涉及重組DNA技術。一方面，本發明涉及甲醇誘導的調節區，另一方面，本項發明涉及葡萄糖存在的條件下被阻遇了的調節區域。還有一方面，本發明涉及整合了本發明的調節區的新型表達載體，以及由此產生的新型轉化體和受調節的多肽的表達。

近年來，由于重組DNA技術的發展，所以就使得控制由微生物產生的各種有用多肽成為可能。許多真核多肽如人生長激素、白細胞干擾素、人胰島素、人胰島素原等等已由多種微生物產生。人們期待將來重組DNA技術能有進一步的發展，以便得到更加有效的方法來利用微生物生產有用的多肽產品。一項吸引人的發展將是調節區域的分離和鑒定，該調節區域可以通過選擇適當的培養基、生長條件或其它條件而很容易地打開和關閉。

例如，Ellis、Brust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras就曾在1985年5月的《分子及細胞生物學》出版物（1111-1121頁）上揭示了DNA序列的分離和特性鑒定，該序列與甲醇的存在相應答，并且在某些分解代謝抑制碳源如葡萄糖存在的條件下，該序列受到分解代謝產物阻遏。本發明是在對上述的參考資料進行進一步的研究后得出的結果。

因此，本發明的一個目的就是對Ellis等的甲醇應答DNA序列的功能性亞片段進行分離和特性鑒定。

本發明的這一目的及其它目的從這里所提供的說明書和權利要求書中明顯可見。

本發明人已驚奇地發現由Ellis、Brust、Koutz、Waters、Harpold和Gingeras（Molecular????and????Cellular????Biology，1985年5月，1111-1121頁）等所公布的調節區的獨特亞片段具有獨特的調節性質;一個這樣的調節區當作為染色體成分引進宿主體內時，在甲醇存在的條件下能夠完全誘導;另一個這樣的調節區當作為染色體外成分引進宿主體內時，甲醇能夠對其進行完全誘導;還有另一個這樣的調節區能夠為定位在下游的異源啟動子核苷酸序列提供這樣一種能力，即在甲醇存在的條件下被誘導而在分解代謝產物抑制碳源存在的條件下被阻遏。

圖1是畢赤酵母屬的伯醇氧化酶基因（AOXI）的5′區的限制性酶切圖譜。

圖2是質粒pSAOH5的限制性酶切圖譜。

圖3是在pBR322基礎之上構建的質粒pPG2.5的酵母插入子的限制性酶切圖譜。

圖4是質粒pBPf3I的限制性酶切圖譜。

圖5是實例中的討論的構建載體的流程圖。

下面的縮寫是用在圖中以代表所用的限制性內切酶。

縮寫????限制酶

A????AvaⅡ

B????BamHⅠ

B₂BglⅡ

Bc????BclⅠ

H₂HincⅡ

H₃HindⅢ

K????KpnⅡ

Nd₁NdeⅠ

Nr????NruⅠ

Ps????PstⅠ

Pv₂PvuⅡ

R₁EcoRⅠ

R₅EcoRV

S????SalⅠ

Sm????SmaⅠ

Ss????SstⅠ

St????StuⅠ

附圖中，用于DNA片段的操作的限制性酶切位點用圓括號將破壞位點的縮寫圈起來表示，不過這些點在連接時被破壞。

本發明提供了一種新型DNA片段，它包括與培養基中的甲醇的存在相應答的調節區，該培養基是與該DNA片段的宿主體相聯系的。當將本發明的一新型片段作為單拷貝整合進宿主體的基因組（即作為染色體成分而不是作為染色體外成分被攜帶）時，它能夠在甲醇存在的條件下促進完全誘導。當作為宿主體的染色體外成分（即在宿主體內作為自主成分維持）或作為染色體成分時，本發明的另一新型片段在甲醇存在的情況下能夠促進完全誘導。當本發明的DNA片段的調節區位于編碼產生mRNA的DNA的5′末端時，它能夠控制mRNA的轉錄。上述DNA片段的突變型和功能等價物也包括在本發明的范圍之內。

“完全誘導”一詞用在本發明書中是指所給DNA片段與甲醇的存在相應答的能力。該詞涉及甲醇與調節區相應答以誘導產生蛋白質產物的水平的能力，該水平與使用同相調節區一結構基因構造物轉化的宿主的野生型AOXI蛋白質編碼序列上游的1Kb非編碼序列新達到的水平相當。