[其他]DNA和它的應用

無效

• 申請號: 87101275
• 申請日: 1987-12-25
• 公開（公告）號: CN87101275A
• 公開（公告）日: 1988-08-10
• 發明（設計）人: 宮川權一郎;木村宏之;隅野靖弘
• 申請（專利權）人: 武田藥品工業株式會社
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P19/40;//
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 辛敏忠

本發明涉及生產肌苷的方法。肌苷是合成5′-肌苷酸時作為起始材料的重要物質。本發明還涉及生產肌苷酸的新微生物及組建這些新微生物所用的新DNA。

人們已知發酵生產肌苷酸是用一種芽孢桿菌（見日本公告專利號2965/1980，41915/1982，42895/1984），Brevibacterium（日本公告專利5075/1976，見農業生物化學1978年42期399頁）或需要腺嘌呤及既需腺嘌呤又具幾種藥物抗性的類似菌株。用這些菌株是由于它們生物合成嘌呤核苷酸的能力都很強。

另一方面，用肌苷酸脫氫酶缺陷型菌株可大量積累肌苷，因為當肌苷酸脫氫酶缺乏時，生產肌苷的一種中間體5′-肌苷酸就可有效地轉化為肌苷，而不轉化為5′-烏苷酸。為此目的，就常用影印法或用諸如紫外線和亞硝基胍（NTG）處理的突變方法篩選需要黃嘌呤或烏嘌呤的菌株。

然而這樣得到的營養缺陷型菌株有很多缺點，例如：由于它們在有關酶的基因以外其它區域的突變，產率會低于它們的母株，也會在發酵期間由于回復突變而使產率浮動。

根據這種情況，本發明人研究了如何得到肌苷酸脫氫酶缺陷型菌株，結果用重組DNA技術將為肌苷酸脫氫酶編碼的基因DNA并入一個來自該基因外的合適的DNA片段，構建出具有這種染色體DNA結構的新的微生物。本發明人發現用這種技術從受體微生物中誘變的新微生物是選自需要腺嘌呤的芽孢桿菌，它們可重復使用于高效穩定地生產肌苷。因為它們可大量積累肌苷，而在發醇過程肌苷脫氫酶活性的回復突變率又低于可觀測的標準。本發明正是基于這個發現而完成的。

因此，本發明包括：

1.為鈍化（失活的）肌苷酸脫氫酶編碼的DNA，它與芽孢桿菌的肌苷酸脈氫酶基因及/或它的兩側區是同質的。

2.上述（1）定義的DNA，它具有插入某一DNA片段的肌苷酸脫氫酶基因區，從而得到所說的失活的基因。

3.如上述（2）定義的DNA，其中的DNA片段是除肌苷酸脫氫酶以外的其它基因。

4.如上述（3）定義的DNA，其中所說的其它基因是選擇標記基因。

5.如上述（1）定義的DNA，其中所說的DNA刪去肌苷脫氫酶完整基因或它的一部分。

6.含有上述〔1〕，（2），（3），（4）或（5）所定義的載體。

7.用上述（1）-（5）定義的DNA或（6）定義的載體轉化的芽孢桿菌。

8.生產肌苷的方法，包括在培養基中培養肌苷酸脫氫酶缺陷型的芽孢桿菌，該菌是用為失活的肌苷酸脫氫酶編碼DNA轉化的，該DNA是與肌苷酸脫氫酶基因區和/或它的兩側區同質的，該菌也可是用插入該DNA的載體轉化的，所以該菌可生產肌苷，并可收集培養液中生產出的肌苷。

為得到本發明所用含肌苷脫氫酶基因的DNA，用常規方法，即用限制性內切酶從微生物染色體DNA中將其切下，例如：可根據日本公告專利156388/1985及相應的歐洲專利0151341的方法分離和克隆DNA。在這種情況下，DNA既含為肌苷酸脫氫酶編碼DNA，又含少量兩側部分的DNA;然而，含有部分肌苷酸脫氫酶基因的DNA或既含部分該基因又含兩側基因的DNA都可應用。

根據上述定義，任何提及的DNA均可用做肌苷酸脫氫酶的整個區，只要該區為一個長1.85千對堿基的XbaⅠ-HincⅡ片段。

作為肌苷酸脫氫酶給體，原則上可用任何的微生物，只要它的肌苷酸脫氫酶區堿基序列與受體芽孢桿菌菌株的該酶編碼DNA序列是高度同質的。從操作的角度最好用芽孢桿菌的，因為它自我無性繁殖，得到的轉化體穩定。給體不一定必需是能生產肌苷，烏苷、黃苷或它們相應堿的菌株。但所用菌株必須不是肌苷酸脫氫酶缺陷型的。可用作給體芽孢桿菌菌株的例子諸如：枯草桿菌，短小芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌，具體可提及下列已知菌株：

枯草桿菌NA-6011（IFO14189.FERMBP-291）

枯草桿菌NA-6102（IFO14190，FERM????BP-292）

枯草桿菌NA-7821（IFO14368，FERMBP-618）

枯草桿菌NA-6128（IFO14373，FERMBP-617）

枯草桿菌NO-115（IFO14187）

枯草桿菌NO168（BGSC????NoIAI）

枯草桿菌MI114（基因124，255〔1983年〕）

短小芽孢桿菌（FERMP-2116）

短小芽孢桿菌（FERMP-4832）

短小芽孢桿菌（FERMP-4829）