[其他]穩定的二核苷酸類組合物和方法

無效

• 申請號: 87100939
• 申請日: 1987-02-23
• 公開（公告）號: CN87100939A
• 公開（公告）日: 1987-11-04
• 發明（設計）人: 戴維·A·約斯特
• 申請（專利權）人: 艾博特公司
• 主分類號: C07H21/02
• 分類號: C07H21/02;G01N33/573
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 林玉貞,曹恒興

概括地說，本發明涉及穩定輔酶類的方法和組合物，特別是涉及穩定在溶液中的NADH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）的方法和組合物。

生化反應幾乎普遍地都是通過酶來催化的，每種酶都是一種蛋白質，該蛋白質在底物中能引發高度特異的化學變化。

對許多種類的酶而言，為了發揮其功能，需要有稱為輔酶的一類低分子量分子參加催化。一般說來，輔酶的化學變化能均衡底物的化學變化，底物的變化是一個反應所期望的結果，例如，輔酶可以從底物中接受氫離子或向底物給出氫離子。

一些臨床診斷化驗包括氧化還原反應，在這些診斷反應中都是起輔酶作用的二核苷酸的那些氧化-還原反應，這些二核苷酸包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸2′磷酸（NADP）和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。

二核苷酸是單核苷酸通過磷酸酯電橋連接起來的，單核苷酸是含氮堿和醣的一種磷酸酯，在NAD和NADP中，第一單核苷酸是由堿腺嘌呤和醣核糖而生成的核苷酸的磷酸酯，而第二單核苷酸是由堿煙酰胺和核糖而生成的核苷酸的磷酸酯，在FAD中，由腺嘌呤和核糖的磷酸酯而生成的第一單核苷酸是與堿7，8-二甲基異咯嗪和糖醇D-核糖醇連接的。

在可逆反應中，無論是NAD還是NADP都可以從還原的底物（Sr）通過用締合的電子接受氫，作為電子受體或對氧化的底物（So）作為電子給體，即：

這些反應的有效特征是，這些二核苷酸（即NADH和NADPH）的還原態能吸收340毫微米波長的光，而氧化態（即NAD⁺和NADP⁺）就不能吸收。因此，在繪出已知酶量的反應速率的校準曲線后，由已知量的底物、該酶的已知活性和在340毫微米處的光密度可觀測到的變化速率，就可以求催化其中一個反應的酶的未知量，同樣，由該校準曲線，已知活性的酶的已知量和在340毫微米處的光密度已測定出的變化速率可以求出催化其中一個反應的酶的底物的量。

雖然以診斷化驗的價值而言，NADH類似其他還原的二核苷酸，在水溶液中是十分不穩定的，由于配制NADH的水溶液要比配制較穩定的干粉形式的NADH更容易的多、更廉價以及更精確，這樣，就給成套診斷化驗的生產者和使用者帶來了特殊的問題。

一種穩定NADH溶液的方法包括把混合物與有機溶劑一起盡可能多地除去水分，在美國專利申請號4，153，511中，采用一種惰性的吸濕劑和一種有機溶劑來獲得含有小于0.5%水的NADH溶液，然而，可得到的非水溶劑的NADH溶液趨向粘性，要準確而又精確地配制達到這一程度是很困難的。

在另一種方法中，如NAD和NADP的輔酶，在酸性pH下，被穩定在一種有機溶劑，最好是如丙三醇或丙二醇的液態多羥基化合物中，如Modrovich美國專利申請號4，153，511所述。然而，這些溶液都比較不穩定且對實際上要求該還原輔酶有100%穩定性的自動化化驗特別不適用。

按照本發明的一種穩定的輔酶組合物包括：一種堿性水溶液;一種還原的二核苷酸，優選的是在水溶液中，在第一濃度下的NADH或NADPH;一種多羥基烷基溶劑，最好是在水溶液中的丙二醇;和硼酸鹽順式羥基鍵聯化合物，最好是在水溶液中，在第二濃度下的硼酸或其鹽，該第二濃度約等于或大于第一濃度。

按照本發明，目前一種優選的、穩定的輔酶組合物包括：pH在約8和約11之間的水溶液;濃度約介于10毫摩爾-500毫摩爾之間的Bicine緩沖液（N-N-二〔2-羥乙基甘氨酸〕）;濃度介于約0.001毫摩爾-50毫摩爾之間的NADH;硼酸濃度至少等于NADH的濃度且在約10毫摩爾-500毫摩爾范圍內;丙二醇濃度介于該水溶液的約20%（體積/體積）-90%（體積/體積）范圍內，最優選的輔酶組合物是其中NADH濃度為10毫摩爾，硼酸濃度為50毫摩爾，丙二醇濃度為50%（體積/體積）和Bicine緩沖液濃度為200毫摩爾并將pH調至約10.0。

按照本發明，一種穩定還原的二核苷酸溶液的方法包括以下幾個步驟：