[其他]在酵母中生產(chǎn)乙型肝炎病毒蛋白質(zhì)的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 87100465
• 申請(qǐng)日: 1987-01-28
• 公開（公告）號(hào): CN87100465A
• 公開（公告）日: 1987-10-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅納德·W·愛利思;阿匹·哈郭拼;彼特·J·肯尼斯肯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 默克有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/00
• 分類號(hào): C12N15/00;C12P21/02;A61K37/02
• 代理公司: 上海專利事務(wù)所
• 代理人: 夏曉

乙型肝炎病毒（HBV）是與若干種人類肝臟疾病有關(guān)的傳染因子。許多被HBV感染的人都經(jīng)歷一個(gè)急性的階段，然后恢復(fù)。然而，有許多人不能根絕感染，從此成為慢性乙型肝炎病毒的攜帶者。HBV感染在世界的許多地方流行，有很高的感染發(fā)生率是在圍產(chǎn)期由患慢性感染的母親傳染給她們的新生兒。全世界的慢性感染（肝炎病毒）攜帶者據(jù)估計(jì)超過三億人。在這些攜帶者中，每年有成千上萬的人死于慢性乙型肝炎引起的病變（肝硬化或肝細(xì)胞腫瘤）。

HB病毒粒子是由兩組結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成的，即核蛋白與外殼或外表（“S”）蛋白。S蛋白除了作為病毒顆粒即Dane顆粒的主要外表蛋白外，它是澳大利亞抗原即22nm顆粒的唯一的組成要素。“S”蛋白質(zhì)為一個(gè)編碼389-400個(gè)氨基酸（具體數(shù)字視血法型而定）的大的開放閱讀框架（ORF）的轉(zhuǎn)譯產(chǎn)物。ORF被分成三個(gè)區(qū)域其中每個(gè)區(qū)域以ATG密碼子開頭，具有在體外作為轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)的作用。這些區(qū)域在基因上相應(yīng)的從5′至3′的順序上分別被稱為pre????S-1（108-119氨基酸）、pre????S-2（55氨基酸）及S（226氨基酸）。從ORF中得出的六種蛋白質(zhì)產(chǎn)物有以下的成份：

1）gp42（42，000道爾頓糖蛋白）＝

pre????S-1/pre????S-2/S（表示pre????S-1與pre????S-2相鄰，再與S相鄰）

2）p39（p＝蛋白質(zhì)）＝pre????S-1/pre????S-2/S

3）gp36＝pre????S-2/S（兩個(gè)糖基化位點(diǎn)）

4）gp33＝pre????S-2/S（一個(gè)糖基化位點(diǎn)）

5）gp27＝S（一個(gè)糖基化位點(diǎn)）

6）p24＝S

在HBVDane顆粒中所有六種蛋白質(zhì)大約都是等克分子的范圍。在22nm顆粒中，4個(gè)較少的蛋白大約是等克分子的范圍，而gp42及p39在每個(gè)顆粒中最多只出現(xiàn)一個(gè)或幾種分子。

22nm顆粒或HB表面抗原（HBs Ag）顆粒已從慢性感染（病毒）攜帶者的胞漿中提純。由于它們的胞漿（血漿）為陽性顆粒的，這些慢性感染的攜帶者被稱為HBs⁺。當(dāng)這些攜帶者發(fā)動(dòng)一次足夠的免疫反應(yīng)時(shí)能夠清除感染而成為HBs^-。由于他們體內(nèi)形成了抗HBs的抗體，這些人是抗HBs⁺的。因此，抗HBs⁺與疾病的痊愈是相互關(guān)聯(lián)的。因而，希望能夠通過HB疫苗來刺激或形成抗體-HBs⁺以提供抵抗HBV感染的保護(hù)作用。

通過實(shí)驗(yàn)來對(duì)這種假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。除人之外，黑猩猩是唯一的對(duì)HBV感染完全敏感的種，這可以通過黑猩猩的諸如HBs⁺、肝酶的血清水平的提高等可以數(shù)量衡量的標(biāo)志反映出來。黑猩猩被用三種劑量的提純的HBs Ag顆粒接種之后，用大劑量的傳染性HBV對(duì)其進(jìn)行襲擊。當(dāng)模擬接種的黑猩猩出現(xiàn)患有急性HBV感染的征兆時(shí)，用HBs Ag接種的黑猩猩得到了完全的保護(hù)而不出現(xiàn)任何感染的征兆。因此，在該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，由gp27及p24（僅為S區(qū)域）組成的HBs Ag顆粒已足以引起保護(hù)性的免疫。在這些現(xiàn)察結(jié)果的激勵(lì)下，有人生產(chǎn)出了由HBs Ag顆粒組成的HB疫苗。

最近的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明pre????S-1及pre????S-2區(qū)域能在抵抗HBV感染的免疫中擔(dān)當(dāng)重要的角色。針對(duì)pre????S-1的抗體（用一個(gè)由pre????S-1的10至32個(gè)氨基酸殘基組成的肽通過免疫作用誘導(dǎo)而得）及針對(duì)pre????S-2的抗體（用一個(gè)pre????S-2的1至26個(gè)氨基酸殘基組成的肽通過免疫作用的誘導(dǎo)而得）在體外實(shí)驗(yàn)中都同樣具有阻斷HBV與人類肝癌細(xì)胞之間的連接的功能。抗HBs（從用缺少pre????S-1或pre????S-2的HBs????Ag接種的病人身上的血清中獲得）不能產(chǎn)生阻斷連接的作用。如果在體外模仿體內(nèi)感染pre-S（即pre????S1及pre????S2全都連接起來）區(qū)域可以代表HBV與其肝細(xì)胞受體之間的連接位點(diǎn)，抗pre????S可以阻斷HBV的連接從而阻斷感染的發(fā)生。此外，還發(fā)現(xiàn)在從急性的HBV感染痊愈的階段中抗pre????S的滴定度增加，表明這些抗體對(duì)痊愈所起的作用。最終，還證明用108氨基酸的pre????S多肽（27-119個(gè)pre????S-1殘基與1-16個(gè)pre????S-2殘基鄰接）對(duì)黑猩猩進(jìn)行接種在某種程度具有抵抗HBV挑戰(zhàn)的保護(hù)作用。總之，這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明pre-S區(qū)域是目前的HB疫苗的有用的成分。