[其他]鹵芳香基腈降解基因，其用途以及含該基因的細(xì)胞

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 87100135
• 申請日: 1987-01-08
• 公開（公告）號: CN87100135A
• 公開（公告）日: 1987-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 斯待卡·大衛(wèi)
• 申請（專利權(quán)）人: 羅訥—布郎克農(nóng)業(yè)化學(xué)公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N9/14;C12N1/20
• 代理公司: 上海專利事務(wù)所
• 代理人: 夏曉

本申請為1986年1月8日提出的編號為817，226的申請的部分繼續(xù)申請，該申請揭示的內(nèi)容在此被采用作參考。

向微生物及高等有機(jī)體的細(xì)胞提供新穎的遺傳特性的機(jī)會，為獲得新的遺傳特性開辟了一條廣闊的途徑。

討論的一個方面是涉及到因其細(xì)胞毒作用而被采用的許多制劑，例如，農(nóng)業(yè)上所用許多化合物直接用于殺滅害蟲、雜草等。在很多情況下，這些化合物具有較長的滯留時間或者持久地殘留。

在許多情況下，人們希望將那些欲殺死的物種與欲保留的物種區(qū)分開來。例如，人們常常想要有選擇地殺死雜草而同時又對莊稼產(chǎn)生最少的不利影響。大部分情況下，許多除草劑都對莊稼產(chǎn)生相當(dāng)大的不利影響，因而這些除草劑的應(yīng)用基本上僅限于備急情況下使用或者次緊急情況下謹(jǐn)慎地使用。

因而要是能夠?qū)罴?xì)胞加以改進(jìn)使之產(chǎn)生對細(xì)胞毒制劑之類的威脅的抗性就具有很大的意義。

美國專利4，535，060號描述了將草甘膦（glyphosate）抗性賦于對草甘膦敏感細(xì)胞的細(xì)菌aro????A基因的應(yīng)用。Hsu和Camper在Can.J.Microbiol.（1976）22卷537至543頁上描述了從富含土壤的培養(yǎng)物分離到苯甲腈（ioxynil）降解物。Hsu和Clemson在Dissert.Abstr.Intrn.B36（1976）第8，3708，號上描述了3，5-二鹵-4-羥基苯基氰一類除草劑的微生物降解作用。Ingram和Pullin在Pesticsci.（1974）第5冊287至291頁上描述了溴苯腈（bronoxynil）在三種類型土壤中持久性。Smith在Abstrp.MeetingWeed????Soc.Am.（1971）的第16至17頁上描述了溴苯腈在勒吉那（Regina）重粘土中的降解作用。

Smith和Fletcher在Hort.Res.（1964）上的4冊第60至62頁上對3，5-二囟-4-羥苯基氰和土壤微生物進(jìn)行了報導(dǎo)。

本發(fā)明提供包含腈水解酶、為這些腈水解酶編碼的核酸順序，含有在一種所需要的宿主（腈水解酶基因?qū)λ鼇碚f是外來物）所識別的調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄的和轉(zhuǎn)譯的調(diào)節(jié)控制下為這類腈水解酶編碼的基因的構(gòu)成物、含有這類構(gòu)成物的宿主細(xì)胞以及含有這些構(gòu)成物的有機(jī)體、有機(jī)體部分或產(chǎn)物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)溴苯腈和/或碘苯腈（ioxynil）特異的腈水解酶可用于含有溴苯腈及有關(guān)的除草劑的產(chǎn)地的去毒性之用，同時可保護(hù)宿主細(xì)胞免受這些除草劑的細(xì)胞毒作用。這些構(gòu)成物發(fā)現(xiàn)可用于區(qū)分那些含有這種構(gòu)成體的宿主細(xì)胞與缺乏這種構(gòu)成物的宿主細(xì)胞。

根據(jù)本發(fā)明，可以提供與囟代羥基苯并腈，特別是3，5-二溴-或3，5-二碘-4-羥基芐腈的水解有關(guān)的新穎的DNA順序、構(gòu)成物及轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞、植物以及肽。本發(fā)明涉及到能夠水解腈的一種酶的生產(chǎn)，以便去除具有殺草活性的腈的毒力，并向?qū)Τ輨┟舾械募?xì)胞，或宿主提供保護(hù)作用或者對含有該除草劑的環(huán)境進(jìn)行解毒。

這種有意義的結(jié)構(gòu)基因可以從顯示出能夠?qū)⒈交枳鳛榈?，通常將苯基氰作為唯一氮源的單?xì)胞微生物中獲得，特別是從細(xì)菌中獲得。關(guān)于芐腈或腈水解酶，意思是指芐腈是一種鹵代P-羥基芐腈，特別是3，5-二碘或3，5-二溴-4-羥基芐腈，腈水解酶是一種能將鹵代芐腈作為氮源，特別是作為其唯一的氮源的水解酶。

這種酶可以通過不同的途徑獲得，可以方便地從天然存在于含有溴苯腈的或磺苯腈的環(huán)境中的細(xì)菌獲得。特別是腸道細(xì)菌，再進(jìn)一步講是克氏桿菌（klebsiella）種，是可獲得這種酶的。肺炎克氏桿菌（klebsiella????pneumoniae），特別是變異體（klebsiella????ozaenae）是可以采用的。這些細(xì)菌可以在土壤或其它芐腈的濃度越來越高的培養(yǎng)基中生長，而不是從土壤中分離，減少其它的可供選擇的氮源直至獲得可用芐腈作為唯一的氮源而生存的細(xì)菌為止。

不管含有腈酶的細(xì)菌的來源如何，進(jìn)行的篩選必須確保腈水解酶對芐腈的去毒作用效力。此外，這種腈水解酶應(yīng)對芐腈具有特異性而不對缺少鹵素的具有其他取代基的其他類似物具有特異性。因此，本發(fā)明的腈水解酶將是正如定義的那樣是對芐腈具有特異性，對于類似物相對地是沒有活性的或者活性低得多。與在可比較的濃度下以芐腈作氮源比較，在正常氮源如氨存在下，細(xì)菌的增殖率最理想的是不應(yīng)顯著減少，就是不少于大約10%。這一結(jié)果對于非特異性的芐腈酶是得不到的。