[其他]改良酵母菌株

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• 申請?zhí)枺?/td>: 86108803
• 申請日: 1987-04-25
• 公開（公告）號: CN86108803A
• 公開（公告）日: 1988-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戴維德·T·羅格斯;托克·W·佐斯塔克
• 申請（專利權(quán)）人: 遺傳學(xué)研究所公司
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12N1/18
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利代理部
• 代理人: 顧柏棣

本發(fā)明涉及酵母、特別是涉及具有較高二氧化碳和乙醇產(chǎn)生速率的面包或啤酒酵母。例如，較高的二氧化碳釋放速率可使面包酵母更迅速地發(fā)酵，而較高的乙醇產(chǎn)生速率則可減少釀造啤酒的時間。本發(fā)明還涉及包括經(jīng)調(diào)節(jié)去除轉(zhuǎn)錄阻斷在內(nèi)的調(diào)節(jié)基因表達的新方法。

酵母是一種最古老的養(yǎng)殖植物，其使用歷史將追溯到公元前2000年。在許多被認識的酵母種屬中，啤酒酵母最為經(jīng)濟和特別重要的，它被廣泛地應(yīng)用于面包制作，釀酒及果酒制造工業(yè)以及生物量的生產(chǎn)中（如見Read.G.，“Yeasts”，Kirk????Othmer????Encyclopedia????of????Chemical????Technology，24：711-806，John????Wiley????&????Sons，New????York，1984）。

雖然不是唯一的，但在發(fā)酵過程中酵母的功能是所提供的二氧化碳和乙醇的主要來源，為此必須將足夠的酵母、麥芽汁或其它可發(fā)酵的底物加入生面內(nèi)，以獲得所期望的二氧化碳和乙醇生產(chǎn)速率。如果使用一種有較大活性的酵母，即可減少酵母的用量，相應(yīng)地降低生產(chǎn)成本。

改進酵母的發(fā)酵能力是不斷對其進行研究的結(jié)果。干酵母和濕酵母均可改良，以提高其二氧化碳產(chǎn)生能力，從而（1）減少發(fā)酵時間和/或（2）使用較少的酵母，以降低制作面包及釀酒的成本。改善酵母發(fā)酵能力亦可制得更穩(wěn)定的活性干酵母（ADY）。一般說來，由新鮮酵母培養(yǎng)物制備ADY，發(fā)酵能力約丟失40%。為消除或減少這一問題，須進一步研究改進。

改善干酵母活性的手段之一是改進干燥方法，或者改善酵母菌株的干燥性質(zhì)，從而防止在干燥期間出現(xiàn)活性丟失。業(yè)已進行了干燥方法的改良，並將傳統(tǒng)的遺傳學(xué)方法用于解決這一問題，且已取得了一定的成功（見美國專利3933783號）。

美國專利4420563號中述及了解決低活性干酵母問題的另一途徑。其改善酵母特別是高糖含量甜面團中酵母之發(fā)酵活性的方法是，在酵母的后期增殖階段向生長的酵母培養(yǎng)物內(nèi)加鹽，從而誘導(dǎo)酵母發(fā)酵活性的提高。

本發(fā)明則是通過遺傳學(xué)和化學(xué)誘導(dǎo)進行修變（modification），以提高酵母菌株的二氧化碳和乙醇的產(chǎn)生活性。

本文公開了增加由酵母產(chǎn)生二氧化碳、乙酵和其它發(fā)酵產(chǎn)物（如檸檬酸）之速率的方法。一般說來，該方法包括降低酵母細胞中的ATP含量，以達到刺激糖酵解的目的。本發(fā)明的一個方面是，通過在酵母基因型中（如通過單拷貝或多拷貝載體，或通過共整合作用進入酵母基因組內(nèi)）用一可調(diào)節(jié)的啟動子置換編碼代謝酶之基因的天然啟動子，使酶得以可調(diào)節(jié)的表達，進而允許由該酶催化的代謝反應(yīng)在逆反應(yīng)的同時進行，以使ATP被消耗。本發(fā)明的另一個方面是，這種修變也包括了將一編碼代謝酶的基因插入酵母基因型內(nèi)，經(jīng)如此處理后即使得基因的表達處于啟動子的表達控制之下，從而允許由該酶催化的代謝反應(yīng)能在逆反應(yīng)的同時進行，進而消耗ATP。此外，本發(fā)明的修變還包括修變編碼代謝酶的基因，從而阻止或消除變構(gòu)或其它抑制作用，或阻止與消除對酶的失活化作用。

在一實施方案中，其所涉及的酶是FDP酶。該FDP酶的基因可被另加誘變，以除絲氨酸外的其它氨基酸的密碼子置換酶的絲氨酸-12的密碼子;或加入某些化學(xué)物質(zhì)（如AMP或/和果糖-2，6-二磷酸）以降低或消除對酶的變構(gòu)抑制作用。在本發(fā)明的另一實施方案中，這種遺傳修變包括了修變細胞外AP酶基因，如通過除去基因的編碼前導(dǎo)序列的部分，使被修變的酶保留在酵母胞漿內(nèi)並催化細胞內(nèi)的ATP水解。

本發(fā)明所提供的一個有利條件在于，遺傳修變過程只能在發(fā)酵期間尤其是在發(fā)酵的早期階段，而不是在酵母生產(chǎn)水平的生長階段被“打開”。這對于制作面包所使用的酵母是一個很重要的有利條件。另外，通過這種遺傳修變可導(dǎo)致酵母的組成表達，使之能在大規(guī)模生產(chǎn)期間即酵母的商業(yè)規(guī)模培養(yǎng)期間被打開，從而得以提高發(fā)酵產(chǎn)物如乙醇的產(chǎn)生速率。

對遺傳修變的調(diào)節(jié)可由一溫度敏感性啟動子或由某特殊化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的啟動子來完成，以使酶只能在預(yù)定的溫度下或者只能在有該物質(zhì)存在的條件下方可得以表達。或者，表達控制亦可通過將-FLP基因構(gòu)建物插入酵母基因組內(nèi)來達到-對此，將在下文中詳細闡述。

用于這些方法的載體包括單拷貝、含有著絲粒的質(zhì)粒和含有酵母2μ復(fù)制原點的多拷貝質(zhì)粒，以及允許共整合進入酵母基因組的載體。

本發(fā)明進一步包括的方法是，通過培養(yǎng)酵母或使酵母與可直接或間接引起ATP消耗的化學(xué)物質(zhì)相接觸以降低ATP水平。這樣的化學(xué)物質(zhì)包括相對小的有機分子以及如酵母殺傷毒素等蛋白質(zhì)。

最后，本發(fā)明還包括了用本文所公開之方法遺傳修變的酵母菌。