[其他]水稻原生質(zhì)體再生植株的技術(shù)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 86108050
• 申請日: 1986-12-05
• 公開（公告）號: CN86108050A
• 公開（公告）日: 1988-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 雷嗚;李向輝;孫勇如;黃美娟
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院遺傳研究所
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 中國科學(xué)院專利事務(wù)所
• 代理人: 劉慕春,李悅

本發(fā)明屬植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

植物細(xì)胞原生質(zhì)體再生植株是用新的非常規(guī)的生物技術(shù)改良作物品種的一個基本環(huán)節(jié)。水稻原生質(zhì)體再生植株是一個難題。直到1985年日本三井東壓公司藤村達(dá)人等（Fuzimura，T..Sakurai.M..Akagy.H..Plant Tissue Culture Letters.2（2）∶74-75，1985）首次發(fā)表了由日本型水稻種子的盾片及未成熟胚的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物來源的原生質(zhì)體在R₂培養(yǎng)基中再生出了植株。

本發(fā)明的目的是用中國水稻品系作材料，在修改的培養(yǎng)基上獲得水稻原生質(zhì)體再生植株。

操作程序

（1）基因型的選?。?/p>

本發(fā)明選用粳稻品系77-170的幼花序，表面消毒后取長約3-10mm的幼花序，置于MS（加2mg/12.4D）培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織。

（2）懸浮細(xì)胞系的建立：

取具有較高分化潛力的表面具小球狀結(jié)構(gòu)的淺黃色愈傷組織，按1g/20ml修改的AA液體培養(yǎng)基的比例，接種入50ml的三角瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃，12h/20℃，12h，150rpm，每3-4天吸出原培養(yǎng)基加入等量的新鮮培養(yǎng)基，兩個月后形成分散均勻、分裂旺盛、原生質(zhì)稠密的胚性細(xì)胞系，該細(xì)胞系中細(xì)胞團(tuán)直徑為250-350um。

（3）原生質(zhì)體游離及純化：

從懸浮細(xì)胞系中取0.5g細(xì)胞團(tuán)加入10ml混合酶液（見附表1），置于黑暗27℃條件下，并輕輕搖動。3小時后95%的細(xì)胞可釋放出具活性的原生質(zhì)體。該混合液經(jīng)孔徑50um的鎳絲網(wǎng)過濾。150g離心5分鐘，吸去酶液后用清洗液（見附表2）清洗兩次，然后用A₂培養(yǎng)基（見附表3）再清洗一次。純化后的原生質(zhì)體用A，培養(yǎng)基懸浮并用血球計數(shù)器計數(shù)。

（4）原生質(zhì)體培養(yǎng)：

將懸浮于A₂培養(yǎng)基中的原生質(zhì)體以8×10/ml的密度接種于2×4cm的玻璃瓶中，每瓶接種1.5-2ml。置于27℃條件下暗培養(yǎng)6小時后，80%以上的原生質(zhì)體出現(xiàn)微微膨大。一天后約20%的再生細(xì)胞開始拉長。第3天出現(xiàn)第一次細(xì)胞分裂，第8天統(tǒng)計時，正常的一次分裂頻率為3-5%。另有部分再生細(xì)胞處于明顯的體細(xì)胞胚發(fā)生的狀態(tài)。15-20天后加入1-2ml含0.3M葡萄糖的A₂培養(yǎng)基，并轉(zhuǎn)移至25℃光強(qiáng)為2000lux的人工氣候箱中，其后每隔兩周分別加入與培養(yǎng)物等體積的含0.2M葡萄糖的A₂培養(yǎng)基和液體A₃培養(yǎng)基。兩個月后將所得的直徑約1mm的再生細(xì)胞團(tuán)連同培養(yǎng)基一起均勻地傾到在固體A₃培養(yǎng)基表面，于相同條件下培養(yǎng)。10天后這種小細(xì)胞團(tuán)即可長成直徑約2-3mm的小愈傷組織，將這種小愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基A₄表面，第10天開始出現(xiàn)綠色芽點，再過一周后同時分化出帶1-2片小葉的綠芽和根。此時將綠芽同根一起轉(zhuǎn)移至相同培養(yǎng)基上，半個月后，發(fā)育出葉片濃綠、分蘗旺盛的完整小植株。將此小植株轉(zhuǎn)移到花盆中，可以正常開花結(jié)實。

本技術(shù)的優(yōu)點：

（1）選用了較好基因型的粳稻77-170品系，并選取有利分化的幼花序為起始材料，易于再生。

（2）采用修改了的系列培養(yǎng)基，促進(jìn)胚性細(xì)胞團(tuán)和胚狀體的發(fā)生，有利于再生完整植株。

附表一：混合酶液成分

Cellulase????Onozuka????R-10????1%

Cellulase????Onozuka????RS????0.5%

Macerozyme????R-10????1%

Pectolyase????Y-23????0.1%

CaCl₂.2H₂O 1470mg/L

KH₂PO₄95mg/L

Sorbitol????0.25Mol

Mannitol????0.25Mol

MES????6，000mg/L

PH5.7

附表二：原生質(zhì)體清洗液成分

CaCl₂.2H₂O 1，470mg/L

KH₂PO₄95mg/L

Sorbitol????0.25Mol

Mannitol????0.25Mol