[其他]直接將DNA插入質體和線粒體無效

申請號：	86107908	申請日：	1986-11-21
公開（公告）號：	CN86107908A	公開（公告）日：	1987-09-30
發明（設計）人：	英格·波特里庫斯;雷蒙德·道格拉斯·希利托;馬麗·戴爾·奇爾頓	申請（專利權）人：	希巴-蓋吉股份公司
主分類號：	C12N15/00	分類號：	C12N15/00;C12N5/00
代理公司：	中國國際貿易促進委員會專利代理部	代理人：	辛敏忠,顧柏棣
地址：	瑞士巴塞***	國省代碼：	暫無信息
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摘要：
搜索關鍵詞：	直接 dna 插入質體線粒體
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【說明書】：

本發明是一種定向的直接將基因轉移到植物細胞原生質體中的質體或線粒體，特別是葉綠體中的一種方法。對本發明來說，植物是進行光合作用的單細胞或多細胞的有機體。植物細胞原生質體是用纖維素酶部分或全部處理細胞壁物質轉變而成的植物細胞。

葉綠體成為某些類除草劑的目標，例如三嗪除草劑。近來發現，阿特拉津（Atrazine），一種三嗪類除草劑，作用于稱為psb????A的葉綠體基因（Hirschberg等，1984）所編碼的32千道爾頓（Kd）的多肽。psb????A的編碼區中的一個單核苷酸的取代導致在32Kd多肽中的一個氨基酸的取代，從而賦予對阿特拉津的抗性。在雜草中發生這種突變的有，例如綠穗莧和龍葵。

能直接引進基因到植物，特別是農作物的質體和線粒體的基因組中去，是人們的宿愿。這樣將能引進新的基因和所期望的特征到所希望的植物中去。例如，賦予除草劑抗性基因，為了在對除草劑敏感的葉綠體中產生除草劑抗性是必要的。

至今，為了得到對在葉綠中具活性的除草劑的抗性或耐性，人們已開始操作植物細胞核的染色體組。但是，這樣一種策略，僅付與對這些除草劑以耐性而不是真正的抗性。還不能通過直接的基因轉移使作物具有對葉綠體作用的真正抗性。因此，也不能認為用這種方法能夠轉化諸如葉綠體的質體。

引進一個具有期望特征的基因，例如除草劑抗性到植物核染色體組的另一個缺點，是由于這種抗性也通過授粉引入了某些雜草。這種雜交將提供將所期望的特征引進雜草中去的機制。

為引進基因到植物細胞核染色體組中去的最普遍的方法是，用致病菌侵染細胞，例如含有Ti質粒載體系統的土壤桿菌屬（農桿菌屬）（Agribacterium）（Barton等，1983，Chilton等，1985）。

這種方法由于侵染而受到損害。其缺點包括限于宿主的特異性和必須將轉化的植物細胞與用于轉化程序的病原分開。在環境中釋放這種病源菌已引起關注（Roberts，1985）。

De????Block等（1985）報導利用土壤桿菌屬Ti質粒載體系統將一個編碼抗生素抗性基因引進能夠再生整個細胞和完整植物的煙草原生質體的葉綠體基因組。然而這些研究者發現在無抗生素存在的情況下，基因是不穩定的，并且在很短的時期內便消失了。只有在抗生素選擇的情況下，植物才能保持引進的基因，因此沒有實際的應用價值。

直接地以缺口線狀或環狀質粒DNA轉化植物細胞原生質體的方法也是眾所周知的（Pasz-Kowski時，1984;Schilperoor等1983）。這種方法無需用病源菌侵染植物細胞，然而到目前為止，這種方限于對核的轉化。

為了能夠授與植物細胞有利的新的性質，而不用病源菌侵染防止這種性質被轉移到雜草中去，需要一種允許直接轉移有用基因進入質體和線粒體基因組的方法。更進一步需要一種能直接將基因穩定地轉移到植物細胞的質體和線粒體以及整個植株的方法，以使在田間作物生長發育期間，基因能穩定地表達而不致丟失。

因此，本發明的主要目的，是提供一種直接將基因引進維持在質體和線粒體，特別是葉綠體中，而不用病源侵染的方法。本發明的進一步目標是產生含有遺傳工程組建的質體或線粒體，能穩定地維持和表達引進性狀的植株。

這個和另一個目標從下面說明中可以看到，由于提供一個將在質體或線粒體中含有一個或多個在質體或線粒體中具有功能的啟動子的基因的DNA，直接引入植物細胞質體或線粒體的程序，這程序包含暴露DNA于在培養基中的原生質體，給予一個充分的時間，讓DNA滲入原生質體和原生質體中的質體或線粒體，而無需將原生質體暴露于病源菌。

圖1是概述構建質粒pCAT°和p32CAT的步驟程序方框圖。

圖2是概述構建質粒pUCHl的步驟的程序方框圖。

圖3是概述構建質粒pBRCAT步驟的程序方框圖。

圖例

X＝XhoⅠ

S＝SmaⅠ

H＝HindⅢ

B＝BamHⅠ

RⅠ＝EcokⅠ

Sl＝SalⅠ

LⅠG＝T₄DNA連接酶的連接作用

X/S1指示一個Xhol位點連接在一個SalⅠ位點的一個兩種酶都不能酶切的雜交位點。