[其他]生產肽的方法

無效

• 申請號: 86107784
• 申請日: 1986-11-14
• 公開（公告）號: CN86107784A
• 公開（公告）日: 1987-06-03
• 發明（設計）人: 前田進;古澤滿;丸本恭正;堀內正;佐藤嘉生;佐伯欣之
• 申請（專利權）人: 第一制藥株式會社
• 主分類號: C12N15/00
• 分類號: C12N15/00;C12P21/02
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 楊松堅

本發明涉及重組體家蠶（Bombyx????mori，蠶）核多角體病毒及應用這些重組體病毒生產肽的方法。

已經報導了利用Bombyx????mori蠶體核多角體病毒（BmNPV）來生產肽的方法（見本文末尾所引用的參考文獻之參考文獻1）。

該方法的主要特征包括應用重組體DNA技術，以一種期望的蛋白質結構基因置換多角體蛋白質編碼結構基因區段，以建造一種重組體BmNPV，并使這種重組體在培養的蠶（家蠶，Bombyx????mori）體細胞中或活蠶（家蠶）體內繁殖，以便在其中積累期望的蛋白質。但是，這種方法在期望的蛋白質的產率方面仍不能使人滿意。

此外，融合的蛋白質的生產也曾在大腸桿菌（Escherichia????coli）體中實施過，但是，其產率也不能說已經有了大的增長（參考文獻2-8）。

本發明就是關于一種重組體病毒，即是一種在Bombyx????mori家蠶體核多角體病毒DNA的多角體蛋白質一個編碼結構基因區段中，具有所期望的蛋白質的結構基因的重組體蠶核多角病毒，它連接到整個或部分的多角體蛋白質一編碼結構基因中。該等基因之間具有或不具有中間插入的連接子堿序列。

本發明也是關于在培養的Bombyx????mori家蠶體細胞中或在活的Bombyx????mori的家蠶體內，繁殖重組體病毒從而生產融合的蛋白質的一種方法。

本發明還進一步是關于在融合蛋白質的連接位點將其分割或分解，從而生產所期望的蛋白質的方法。

在本文的附圖中，

圖1至圖6通過一個舉出的實例，用示意圖表明用于生產重組體病毒的某些質粒的建造圖解。

圖7及圖8是所期望的融合蛋白質的電泳圖示。

BmNPV是養蠶工作者所廣泛地知道的。T3菌株是由本發明者所分離來的一種典型的菌株。這種菌株的病毒DNA（BmNPV????DNA）已經存放于在美國典型培養物保藏中心（ATCC），其登記號碼是ATCC????40188。

為了從這種病毒的DNA中分離出含多角體蛋白質的結構基因的一個區段，用限制性內切酶（EcoRI）的處理來處理是適合的，如參考文獻1所述，其中有一種帶有質粒pBmE36的大腸桿菌菌株（E.coli????K12JM83????DGB-0036），而質粒中含有病毒DNA的EcoRI-EcoRI片段〔約10.5千堿基（kb）〕，該片段是在EcoRI分裂位點插入到質粒中。此種菌株現已存放到日本通商產業省，工業科學與技術廳，發酵研究所，登記號碼是FERM????BP-813。

此外正如在參考文獻1所敘述的那樣，當應用HindⅢ處理pBmE36時，可得到含有多角體蛋白質的結構基因而長度約為3.9千堿基（kb）的片段。然后將此片段插入一市售的質粒pUC9〔可由P-L生物化學藥品公司（Pharmacia????P-L????Biochemicals）買到〕。隨后的EcoRI分割，Bal31處理（在此，不同長度的片斷可通過調節處理時間而得到）此及進一步的HindⅢ分割，或者用一種相似的方法可提供包括全部或部份多角體蛋白質基因的片段。

應用一種適當的連接子（DNA）（參考文獻19），可將所期望的蛋白質的一種結構基因，連接到整個或一部份多角體蛋白質基因上，而對所產生的融合蛋白質，當用一種適當的工具在由相應的連接子堿基順序翻譯成的氨基酸或肽的位點上分割時，可生成期望的蛋白質，然后可用通常的方法將其分離。當這種融合蛋白質本身就可應用時，自然不需要分割的步驟，在這種情況下;連接子也不需存在。

眾所周知，在相當于連接子的肽或氨基酸（連接部份）及用于分割或分解融合蛋白質的各種工具之中所包括的分別是：異亮-谷-甘-精的序列及能夠分割序列的凝血因子Xa（下面簡稱“F-Xa”）;脯-Ama-甘-脯（其中Ama是任何一種氨基酸）及能夠分割序列的膠原酶;精氨酸或苯丙氨酸及能夠分割在融合蛋白質之后的肽鍵的胰蛋白酶;酪氨酸或苯丙氨酸及能夠分割在融合蛋白質之后的肽鍵的糜蛋白酶;脯氨酸-精氨酸及能夠分解在融合蛋白質之后的肽鍵的凝血酶;色氨酸及能夠分解融合蛋白質的N-溴代丁二酰亞胺;以及甲硫氨酸及能夠分解融合蛋白質的溴化氰（參考文獻2-10）。連接部份及分割或分解的工具并不限于上述者。許多其他的各種肽的組合物或氨基酸以及各種的化學的或酶促的方法均可分別用作連接區段及分割或分解的工具。

較理想的是，所期望的蛋白質不含有任何一種氨基酸或肽，而該氨基酸或肽暴露在上述的連接區段分割或分解的過程時則會被分解。但是，限制性地應用恰當地受限制及緩和的條件去分解融合蛋白質，則也可能藉此達到目的。