[其他]快速簡便分離篩選產L-多巴(L-DOPA)菌株的方法

無效

• 申請號: 86104727
• 申請日: 1986-07-19
• 公開（公告）號: CN1004008B
• 公開（公告）日: 1989-04-26
• 發明（設計）人: 彭珍榮
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 代理公司: 武漢大學專利事務所
• 代理人: 詹玉清

本發明是創造了一種快速、簡便的方法，能分離、篩選到產Ｌ－多巴（Ｌ－Ｄｏｐａ）的菌株。Ｌ－多巴是一種預防、治療帕金森氏病，一氧化碳中毒等病癥的有效藥物，用本發明所要求分離、篩選的一類菌株生產它，工藝簡單，適于工業化大生產。本發明是從土壤取樣，稀釋樣品，在選擇培養基上分離菌落，選擇革蘭氏陰性有沉淀環的黃色菌落，進行產Ｌ－多巴的定性和定量檢測。用該方法篩選到的轉化Ｌ－酪氨酸成Ｌ－多巴的菌株，轉化率達６０～９７％。

本發明屬于從微生物的培養介質中分離微生物的方法（國際專利分類號為：cl2N1/02）。

L-多巴（L-Dopa）是預防、治療帕金森氏病、震顫性麻痹綜合癥、一氧化碳中毒、錳中毒等病癥的有效藥物。現在，可以從野生植物藜豆中提取、化學合成等途徑制取此藥。但這些方法原料來源有限、工藝復雜、產率低、成本高。用微生物發酵催化L-酪氨酸合成L-多巴，其優越性是工藝簡單，經濟合算，適于工業化大生產，因此，必須獲得高產L-多巴的菌株，但用常規方法分離、篩選產L-多巴菌株，不僅手續繁雜，時間長，而且很難得到產L-多巴的菌株。對比現有技術的不足和本發明的優點：

1.現有技術是從收集各種來源的菌株進行篩選產L-多巴的菌株C，D，但是現能轉化L-酪氨酸成L-多巴并轉化率高（指對L-酪氨酸）的菌種很少，從大量的現有已分離、鑒定的菌中篩選率很低，很難得到產L-多巴轉化率高的菌株，對比文獻D用147株菌，僅篩選到6株產L-多巴菌，而本發明改進現有技術，利用準確可靠的采樣，使篩選率大大提高，曾從10個樣品中篩選到8株產L-多巴菌。

2.現有技術進行篩選產L-多巴的菌株是利用已經分離、培養、鑒定和保藏的菌株，此分離、培養、鑒定的過程，大都是根據文獻B的常規法進行，使用培養基種類多，操作繁雜，時間長，就文獻A而論，是現有技術中能較快地從土壤中分離、培養，鑒定嗜麥芽假單胞菌，還沒有檢測是否產L-多巴，也要進行20多天，如果要進一步篩選產L-多巴的菌株，就總共要一月左右的時間，還不一定能篩選到產L-多巴的菌株，而本發明人曾利用本發明所獲得的產L-多巴的菌株都是嗜麥芽假單胞菌，所需時間，再加上鑒定到種名，不超過16大。

3.現有技術是對每個作為篩選對象的菌株，經斜面，種子、發酵培養后進行檢測L-多巴的量，所以工作量大，手續繁雜，要這樣篩選大量的菌株，才能得到產L-多巴轉化率高的菌，效率很低，時間長，對比文獻D中147株菌，就要分別進行147次這樣繁雜的篩選，而本發明由于經過創新的選擇培養基對來自樣品中的微生物進行了選擇，并用特有的三個選擇菌落指標選擇分離菌株，作L-多巴定性檢測，最后才進行種子、發酵培養、檢測L-多巴的量，所以要進行種子、發酵培養、檢測L-多巴量的這一繁雜步驟的菌株很少，大大節省了人力、物力和時間。發明人曾從10個樣品中篩選到8株產L-多巴菌，也只做了8次這繁雜的最后一步驟，而且，篩選到的8株轉化L-酪氨酸成L-多巴的菌株，轉化率達60～97%，最好的一菌株能將8.6克/升L-酪氨酸催化合成8.4克/升L-多巴，轉化率達97%。因此，本發明是一種快速、簡便的方法，能很準確地分離、篩選到產L-多巴并且轉化率高的菌株。

本發明的技術路線是，采取十字花科植物的根系土壤，將所采土壤與適量的無菌生理鹽水混勻，然后再用無菌生理鹽水按10倍稀釋，取上述處理好的樣品涂布在選擇培養基上，在24°～30℃溫度下培養3～7天，得到單個菌落。該選擇培養基的組成如下：

蛋白胨 10～20克

NaCl 2～5克

CaCl₂ 0.1～0.5克

吐溫80（或吐溫60，或吐溫20） 10～20毫升

蔗糖 1～4克

瓊脂 15克

水 1，000毫升