[其他]蛇毒抗栓酶的制備方法

無效

• 申請號: 86104422
• 申請日: 1986-06-24
• 公開（公告）號: CN86104422A
• 公開（公告）日: 1988-01-06
• 發明（設計）人: 郝文學
• 申請（專利權）人: 中國醫科大學
• 主分類號: A61K35/58
• 分類號: A61K35/58
• 代理公司: 沈陽市專利事務所
• 代理人: 于麗影

本發明提供一種從蛇毒中制取蛇毒抗栓酶的方法，屬于藥品的生產方法。

蛇毒抗栓酶的主要成份是精氨酸酯酶等抗凝成份，它具有抗凝、去纖、降脂、溶栓、擴張血管等多種功能，適用于腦血栓、血栓閉塞性脈管炎等常見的缺血性疾病。目前治療這些疾病的藥物很多，但尚無滿意療效。本發明生產的蛇毒抗栓酶經臨床一千余例病人試用，總有效率達90%以上。

目前國內外均有以蛇毒提取精氨酸酯酶的報道，并已純化作為藥品出售，它們的商品名稱分別為：Ancrod??Reptilase????Crotalase。但這些方法均具有生產步驟復雜、生產周期長、產量低、價格昂貴等缺點。

本發明的目的在于提供一種從蛇毒中制取蛇毒抗栓酶的簡便方法，縮短制取周期，增加每克蛇毒制取蛇毒抗栓酶的量，并使該藥物毒性低、療效高。

本發明是這樣實現的：取干蛇毒以1∶（10～12）的比例溶于Tris-Hcl緩沖液中，再倒入已經處理好且已平衡的DEAE-葡聚糖凝膠分子篩層析柱中，用0.01MTris-Hcl做緩沖液進行三步洗脫，控制流速，洗脫液流經紫外檢測儀記錄其流出曲線。按記錄儀所描繪出的曲線，合并有效組分的洗脫液，用專一性底用TAME（a-甲苯磺酰-L精氨酸甲酯鹽酸鹽）測定精氨酸酯酶的活力，按活力加稀釋劑，攪拌均勻，除菌過濾，加防腐劑慶大霉素，分裝冷凍干燥制成凍干粉劑。每支蛇毒抗栓酶0.25單位。

本發明洗脫液的PH值應保持在PH7.0～7.4。操作時的溫度應控制在12～14℃。防腐劑為10～12萬單位/萬支慶大霉素。

本發明與現有技術相比有如下優點：

1、由多次上柱改為一次上柱，使生產周期由10～15天縮短為7天，減少了酶制劑在生產過程中的污染機會，簡化了方法，而制劑的療效不變。

2、洗脫液的PH為7.2，是最佳的條件，可使每克蛇毒制取的精氨酸酯酶由1000～1500支提高到2500支（每支均為0.25單位），明顯提高了產量。

3、操作溫度由常溫改為14℃，可使酶活力達到最好狀態，亦可提高產量。

4、在凍干粉劑中加用適量的慶大霉素，可顯著減少蛋白質制品的污染，避免浪費。

本發明實施例如下：

一、分子篩處理

1、新膠處理。稱取DEAE-葡聚糖凝膠分子篩30～50克。加水2000～2500ml膨脹，用0.01M????Tris-Hcl緩沖液平衡，直至上清液的PH與緩沖液PH相似（7.0～7.4）。

2、再生膠處理。將用過的膠倒出，用蒸餾水反復洗至無咸味，然后用堿矸、酸、堿矸處理至中性。

二、膠上柱

1、層析柱處理。選擇110cm柱長的層析柱和G1號篩板，常規處理后，將篩板用薄乳膠膜包對，置于柱下口，緊貼膠塞（以免漏水），將兩者密合后，垂直安裝在鐵架上，用乳膠管連接下口，加入0.1M????Tris-Hcl緩沖液。

2、膠上柱。將柱中Tris-Hcl緩沖液緩慢由下口放出，留三分之一，再加入已處理好的膠，攪拌至無斷層現象，待底層自然下沉的膠可見有10cm厚時，以25滴/分的速度緩慢放緩沖液，直至達到平衡。

三、上樣

稱取5克干蛇毒，加1∶10Tris-Hcl緩沖液置冰箱12小時后，以3000轉/分離心20分鐘后吸取上清液均勻地由中心向四周滴加于膠床上，待樣品依其自身的高密度自然進入膠床后，繼續加等量緩沖液在膠面上，反復兩次，將乳膠管與檢測儀連接好，以備檢測。

四、洗脫

洗脫共分三步進行。洗脫液分裝在兩個瓶內（攪拌瓶和貯存瓶。兩瓶以膠管連接）。

第一梯度洗脫液為0.01M????Tris-Hcl2400ml，勻速洗脫，洗脫液流經蛋白測定儀，第一洗脫液呈1、2、3峰。

第二梯度洗脫液由2400ml????Tris-Hcl和2400ml4MNaCl組成，洗脫液呈4、5、6、7、8、9、10七個峰。

第三洗脫液由0.27MNaCl????1000ml和0.7M????NaCl1000ml組成，此段洗脫液呈11、12、13、14四個峰。當測定儀指示出直線時，洗脫完畢。合并有效組分，按常規方法測定精氨酸酯酶的活力，加慶大霉素10～12萬單位/萬支，稀釋凍干，每支蛇毒抗栓酶含精氨酸酯酶0.25單位。以上工作一旦進行，不得中斷。分離時最佳室溫為14℃，洗脫液PH為7.2。