[其他]細菌酶

無效

• 申請號: 86104387
• 申請日: 1986-05-09
• 公開（公告）號: CN86104387A
• 公開（公告）日: 1987-04-22
• 發明（設計）人: 索倫·莫林;邁克爾·吉夫斯科夫;埃里克·里斯
• 申請（專利權）人: 阿爾弗里德·本佐恩公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/00;//
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利代理部
• 代理人: 顧柏棣

本發明涉及生產細菌酶的方法以及制備用于該方法的雜交質粒和微生物，本發明進一步涉及到利用上述酶中的一種，核酸酶，從生物物質中去除核酸，還涉及用于啟動基因表達的調節區。

人們發現沙雷氏菌屬的細菌（Serratia????Spp.）產生一些分泌到培養基質中的水解酶。與其它格蘭氏陰性細菌不同，它們傾向于將蛋白質分泌到外周胞質中而不是周圍的基質中。這種外周胞質蛋白有滲漏到培養基質去的趨勢，特別是當細菌生長到密度很高的時候。

根據本發明，分離得到了編碼沙雷氏菌胞外酶的DNA，當然，此胞外酶是在細菌內表達的，而且已培養出適于基因產品的工業生產并含有沙雷氏菌DNA的微生物，并發現它們能產生沙雷氏菌的酶。

還發現如果含有編碼沙雷氏菌胞外酶的插入DNA的雜交質粒被另一個本身通常不向培養基質分泌基因產品的微生物，如大腸桿菌（E.Coli）所包含時，那么大腸桿菌則也能在一定程度上向培養基質中分泌沙雷氏菌的酶（參見實例1和6）。因此，有可能以一個比較簡單的方法對由大腸桿菌的細胞分泌到培養基質中的沙雷氏菌酶進行部分純化，例如，簡單地通過過濾除去大腸桿菌細胞，并在濾液中用例如硫酸銨來沉淀酶。在本文中，術語“分泌”應理解為基因產物的轉移至少要通過細胞的細胞質膜。

于是，本發明的一個方面涉及到一種生產細菌酶的方法，它包括在培養基質中培養一種包含具有編碼沙雷氏菌胞外酶的沙雷氏菌DNA的雜交質粒的細胞，以及從培養基質中收集這種酶。

在一個具體的實施方案中，本發明涉及一種生產基本上不含有其它細菌蛋白質的沙雷氏菌酶的方法，在該方法中，該酶的一部分由微生物分泌到培養基質中，并從這些培養基質中收集。

該微生物的培養最好在含有此微生物的最佳生長所需養分和無機物的液體培養基中進行?？梢杂帽旧硎且阎姆椒▉硎占?，如上所述，可以由過濾除去宿主細胞來純化酶，并從濾液中沉淀出核酸酶。通常，然后把沉淀物溶于適當的緩沖液中，例如Tris-EDTA中，然后由透析法除去沉淀劑。

沙雷氏菌產生的水解酶中包括一種將核酸水解為核苷酸、寡核苷酸或較小核酸片段的核酸酶，以及一種水解脂類中的脂肪酸和磷脂的脂酶和磷脂酶。

所用微生物是一種典型的細菌，最好是革蘭氏陰性菌。通常不希望使用沙雷氏菌來生產沙雷氏菌酶，因為沙雷氏菌是一種機遇病原菌，這可能限制人們利用它作為生產用的微生物。此外，沙雷氏菌還產生一種可能污染所需產品的胞外蛋白酶。用于生產沙雷氏菌酶的微生物，最好是象大腸桿菌這樣的通常用于生產基因產品的革蘭氏陰性菌。

本發明還涉及帶有沙雷氏菌DNA的雜交質粒，這種DNA編碼一種如上所述的沙雷氏菌胞外酶。

生產本發明的酶時，作為載體使用的質粒可以是通常用于這一目的的任何質粒，它在有關微生物中能夠進行復制?？捎脕懋a生大量上述酶的質粒包括所謂的失控質粒，就是說它具有不受條件控制的復制特性。具有這種特性的質粒已在例如美國專利4，495，287和公開號為0109150的歐洲專利申請中公開了。

細菌核酸酶在純化用微生物發酵制備的蛋白產品中有重要價值，這樣的蛋白產品有用經過DNA重組技術改造的細胞發酵制備的產品，這些細胞能產生該種的天然細胞不能產生的產品。在這些產品的純化中，一個重要的步驟是從這些由細胞產生的核酸中分離出蛋白產品。如果使用象核酸沉淀這樣的常規化學處理進行純化，由于含有所需產品的物質具有較高的粘度而難于分離，可能引起所需產品的損失，而用核酸酶分解核酸則不會引起所需產品的任何重大損失。并且，從產品中有效地完全除去核酸是很重要的，例如當產品用于人類時，一些國家的衛生管理當局規定，產品中不應含有來自用于生產有關產品的細胞的任何可雜交的DNA。

因此，沙雷氏菌產生的很重要的酶中包括一種已發現是很有效的核酸酶，它能從生物物質中除去核酸，因而具有很重要的工業價值。在本文中，術語“除去核酸”意指把長的核酸序列降解為較短的片段或寡聚核苷酸或在某些情況下降解成為單核苷酸或二核苷酸。這意味著由核酸酶作用產生的產物可以相當容易地通過常規方法除去。

因此，本發明還涉及一種細菌核酸酶，它是具有下列氨基酸序列的沙雷氏菌核酸酶，（根據已知方法由DNA序列推定，并包括了N-端信號肽）：