[其他]齲齒預防制劑和制備該制劑的方法

無效

• 申請號: 86102686
• 申請日: 1986-04-09
• 公開（公告）號: CN86102686A
• 公開（公告）日: 1987-10-21
• 發明（設計）人: 松代愛三
• 申請（專利權）人: 松代愛三
• 主分類號: A61K7/28
• 分類號: A61K7/28;C12N9/24
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 巫肖南

本發明一般地涉及用于確保外源基因產物的微生物表達的重組方法和材料。特別是涉及用于預防齲齒的微生物制劑和其生產方法。

Streptococcus????mutans通過由蔗糖合成細胞外多糖聚合物粘附于牙釉質的表面，而引起齲齒。這些多糖中最重要的就是葡聚糖。第一種類型的葡聚糖主要含有α-1，6鍵（見圖1），類似于經典的右旋糖酐（dertrans）。第二種類型的葡聚糖則主要含有α-1，3鍵，且不易溶于水。S.mutans和其它生齲微生物粘附于牙齒表面并分泌有機酸和其它物質而引起牙齒腐蝕，其分泌的有機酸和其它物質可引起牙齒結構之無機成分的脫礦質作用，以及殘存有機基質的溶解作用。

過去是用牙刷刷牙和使用牙用涂臘緒絲，機械地除去牙齒噬斑（噬斑為一種生齲細菌、不溶性葡聚糖和其它材料的復合物）。然而，重要的是在牙齒被強力刷凈之后，細菌又迅速地在幾分鐘內吸附于牙釉質表面，之后在一、兩天內又出現放大鏡下可見的菌落。另外，因為噬斑常完整地保留在牙刷或牙用涂臘緒絲難于達到的部位，故很難確保徹底地清潔牙齒。

最近出現了一系列通過酶分解不溶性葡聚糖聚合物的α-1，3和α-1，6糖苷鍵的牙膏。這類牙膏的特點是含有α-1，6葡聚糖6-葡聚糖水解酶（α-1，6葡聚糖酶或右旋糖酐酶）或α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶（α-1，3葡聚糖酶）。在美國專利4，486，330號中，Yoshida等人公開了用于人假牙的清潔組合物，是含有溶于適當緩沖液的β-1，3葡聚糖酶。Simonson等人在美國4，328，313號專利中，Guggenheim等人在美國4，353，891號專利中，公別公開了用于噬斑擴散的α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的生產方法。在美國4，438，093號專利中，Shimada等人則公開了一種用于預防和抑制口腔疾病的口服組合物，由存在于藥用載體上的α-1，3葡聚糖酶和α-1，6葡聚糖酶組成。應用含有裂解這種不溶性葡聚糖的酶的牙膏，在刷牙之后不能期望具有分解牙齒噬斑的明顯作用，這是因為牙膏的酶成分在刷牙后例行的沖洗時趨于流失。

迄今尚沒有使用重組方法克隆和分離α-1，3或α-1，6葡聚糖酶基因的報導。

根據上面對現有技術的描述，顯然需要有一種技術來改進在人類口腔中提供葡聚糖酶活性的方法和材料。這樣的方法和材料最好應能長時期恒定地提供葡聚糖酶活性，并最好不需要頻繁地使用即可達到目的。

本發明提供不同基因組的DNA組成的重組DNA分子，此重組DNA是在活細胞外末端連接起來的，且具有轉化宿主細胞并繼續存在于宿主細胞和其后代中的能力。此重組DNA含有選自一組編碼α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的DNA序列，并含有為表達編碼α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的前導DNA片段雜交的DNA片段。本發明還提供表達α-1，3葡聚糖3-葡聚糖水解酶的DNA分子來轉化的宿主細胞。特別舉例說明的是大腸桿菌和鏈球菌宿主。本發明也提供含有編碼α-1，6葡聚糖6-葡聚糖水解酶的基因的重組DNA分子。

本發明進一步提供在口腔內引入和長期維持葡聚糖酶活性的方法和材料。明確地說，本發明包括（1）克隆一種產生α-1，3葡聚糖酶、α-1，6葡聚糖酶或其兩者的細菌的基因，（2）用此等基因轉化一種口腔固有的細菌，以使其表達和分泌該基因產物，以及（3）將轉化了的細菌引入口腔內。引入口腔內的轉化之生物體的濃度，應能持續地在口腔中表達和分泌足夠水平的α-1，3葡聚糖酶、α-1，6葡聚糖酶或其兩者，以便降解牙齒噬斑的葡聚糖并防止這種噬斑的聚集，同時防止生齲細菌粘附于牙齒上。對于降解構成牙齒噬斑的不溶性葡聚糖物質來說，結合使用α-1，3葡聚糖酶和α-1，6葡聚糖酶，可產生協同作用。因此，可分別或同時將用于表達和分泌這兩種類型葡聚糖酶的基因，引入口腔所固有的一種或不同種轉化菌內，并施用于本發明的方法。

下列對本發明的優選實施方案的詳細描述，將使本發明的其它方面變得更為清楚。

圖1顯示不溶性葡聚糖的結構;

圖2是存在于大腸桿菌胞漿中的PYEJ001質粒的基因圖;

圖3是存在于Streptococcus Sanguis胞漿中的_pGB301質粒的基因圖;

圖4是制備穿梭載體_pMN1的圖解說明，該載體是經分別用HaeⅢ和SmaⅠ切斷S.Sanguis的質粒_pGB301（9，8Kb）和大腸桿菌的質粒_pUc 9（2.8Kb），并用T₄連接酶將它們連接在一起而制得的;