[其他]重組DNA表達載體和編碼異青霉素N合成酶的DNA復合物

無效

• 申請號: 86102604
• 申請日: 1986-04-21
• 公開（公告）號: CN86102604A
• 公開（公告）日: 1986-11-26
• 發明（設計）人: 托馬斯·多米尼克·英戈利亞;斯蒂芬·懷亞特·奎因納;休倫·瑪麗·薩姆森;保羅·盧瑟·斯卡特魯德
• 申請（專利權）人: 伊萊利利公司
• 主分類號: C12N11/00
• 分類號: C12N11/00;C12N15/00;C12N9/00
• 代理公司: 中國專利代理有限公司
• 代理人: 劉元金

本發明涉及編碼異青霉素合成酶活性的DNA序列。異青霉素合成酶催化由δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-纈氨酸生成異青霉素N的反應。該反應是生物合成一些重要抗生素的一個關鍵步驟，如來自Penicillium????chrysogenum、Cephalos-porium????acremonium和Streptomyces????clavuligerus的青霉素;未自C.aremonium的先鋒霉素;以及來自S.clavu-ligerus的7α-甲氧基先鋒霉素。

編碼異青霉素N合成酶活性的新的DNA序列是由頂頭孢霉（Cephalosporium????acremonium）中分離的，已用來構建驅動該活性表達的重組DNA表達載體。這些表達載體中，有兩種類型特別有用。第一種類型的載體驅動大腸桿菌中異青霉素N合成酶活性的高水平表達，而第二種類型的載體則驅動頂頭孢霉中該酶活性的表達。

大腸桿菌產生的異青霉素N合成酶活性，已在由δ-〔L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-纈氨酸轉變為異青霉素的體外試驗中顯示出來。用本發明的大腸桿菌載體轉化的大腸桿菌的細胞粗提液，無需預先活化處理即具有異青霉素N合成酶活性。因此，本發明的大腸桿菌載體為得到大量活性異青霉素N合成酶提供了一種有效的工具。異青霉素N合成酶不僅對于生產異青霉素N是有用的，而且對于縮合δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-纈氨酸以外的其它三肽，以形成新的抗生素也是有用的。

本發明的頭孢霉載體可用于菌種改良目的。頭孢霉是一種在生產青霉素和頭孢霉素中有重要經濟價值的微生物。用本發明的某些重組DNA表達載體轉化Cephalosporium，導致在轉化菌體內以高水平產生異青霉素N合成酶，因此表現出增加了這些轉化菌的發酵過程的效率和產率。

編碼異青霉素N合成酶的DNA復合物，很容易改建成其他表達載體，用以增加其它微生物，如Penicillium????chrysog-enum和Streptomyces????clavuligerus的發酵過程的效率和產率。雖然本發明中編碼異青霉素N合成酶的DNA是由C.acremonium中分離的，但該DNA復合物亦可用于構建那些在多種宿主細胞內驅動異青霉素N合成酶活性表達的載體，例如本發明的大腸桿菌載體。所有產生青霉素和頭孢霉素的生物體均利用共同的前體δ-（L-α-氨基己二酰）-L-半胱氨酰-D-纈氨酸和異青霉素N。因此，本發明的編碼異青霉素N合成酶的DNA化合物，可用于制取一些有用的載體，它們可改善產生青霉素和頭孢霉素的所有菌屬的微生物發酵效率和產率。

本發明的DNA復合物是由頂頭孢霉的基因組DNA中得到的，其核苷酸序列十分同源于S.chavuligerus、P.chrysog-enum以及其它產生異青霉素N合成酶的生物體中編碼異青霉素N合成酶活性的DNA復合物。由于這種同源性，故本發明的編碼異青霉素N合成酶的DNA復合物可被標記，并用于篩選產生異青霉素N或相似化合物的生物體的基因組文庫中異青霉素N合成酶類型的酶。許多微生物都包含這樣一些DNA：即它們編碼相當于由本發明的DNA組合物所編碼之活性的異青霉素N合成酶活性，而本發明即包括了這些相當的DNA組合物。

本發明的編碼異青霉素N合成酶的DNA組合物得自于頂頭孢霉基因組DNA，并以與轉錄和翻譯活化序列結合的方式被分離，此活化序列控制編碼頂頭孢霉異青霉素N合成酶之基因組DNA的表達。本發明也包括該新的轉錄和翻譯活化序列，如本文所公開的，此序列已被用于驅動頂頭孢霉中異源基因的表達。

本發明還包括異青霉素N合成酶（IPS）基因的調節信號，這些信號位于IPS基因編碼區的編碼鏈之3′端。這些3′調節序列編碼IPS基因的轉錄終止、mRNA多聚腺苷酸化和加工信號。這些信號存在于表達載體中適當的位置，即在被表達的基因編碼區之編碼鏈的3′端，可提高頂頭孢霉中該載體編碼的預期產物的表達。

以下部分提供對本發明的更詳細的描述。為了使本文說明書中和權利要求中所用的一些名詞更清楚并幫助讀者了解本發明，故對以下條目定義如后。

抗生素-一種由微生物產生的物質，為天然的或進行了有限的化學修變的，可抑制其它微生物或真核細胞的生長，或者殺死這些細胞。

抗生素生物合成基因-編碼一種酶活性的DNA片段，該酶活性在由原始代謝物轉化成抗生素的過程中某一酶促反應所必須的。